通过生物素化右旋糖酐掺入制备pMHC和TCR的多聚体

通过生物素化右旋糖酐掺入制备pMHC和TCR的右旋聚合物(dextramers)，检测和监测抗原特异性T细胞或抗原呈递过程

pMHC多聚体可通过流式细胞术和荧光显微镜在单细胞水平上实现对抗原特异性T细胞亚群的检测、分析和分离。这些标记试剂利用了多价支架结构，以增强原本较弱的TCR与pMHC之间的相互作用。Dextramer技术是对最初基于链霉亲和素的tetramer（四聚体）技术的改进，因为其具备更高的多价性，从而提高了检测灵敏度，适用于稀有且低亲和力的T细胞，包括自身/肿瘤反应性克隆。然而，商业化的pMHC Dextramer价格昂贵，而自行制备对一般的生物医学实验室而言过程又过于复杂。这里加州理工学院提出了一种简便且经济的pMHC Dextramer制备方法：在常规tetramer制备过程中加入生物素化右旋糖酐/葡聚糖进行掺杂。利用这些pMHC Dextramer识别了来自患者的肿瘤反应性T细胞。此外，还采用相同的右旋糖酐掺杂技术制备了TCR Dextramer，并利用这些新型试剂进一步加深了对MHC I类分子介导的抗原呈递机制的理解。

T细胞是适应性免疫的核心介导者。每个初始T细胞独特的特异性由TCR决定，TCR可结合由MHC分子呈递在靶细胞表面的抗原肽。TCR与单体pMHC复合物的亲和力（Kd≈0.1-400μM）远弱于典型抗体-抗原相互作用的nM级亲和力。为了实现对抗原特异性T细胞的直接和稳定标记，可以将4个生物素化的pMHC单体以非共价方式组装在一个带有荧光标记的四聚体链霉亲和素核心周围（图1A）。这种pMHC四聚体利用结合协同性降低了TCR-pMHC相互作用的解离速率，从而可通过多色流式细胞术检测和追踪抗原特异性T细胞亚群。然而，使用pMHC四聚体难以有效检测携带低亲和力TCR（>80μM）的T细胞。这一问题在检测介导自身免疫和抗肿瘤免疫的T细胞时尤为突出，因为胸腺选择过程会清除对非突变自身抗原具有高亲和力的T细胞。

提高pMHC多聚体的结合强度超过四聚体的水平，可以改善对低亲和力T细胞的检测。例如，高阶pMHC多聚体（如dextramer以及dodecamers(十二聚体)）能够检测到的特异性CD8+ T细胞数量比相应的四聚体高出2-5倍。目前，商业化的pMHC dextramer（Immudex）是通过将生物素标记的pMHC单体组装在一种同时连接链霉亲和素和荧光染料的葡聚糖支架上构建而成（图1A）。这种双功能葡聚糖支架并未作为商品出售，因此现成可用的dextramer价格昂贵。此外，链霉亲和素和荧光染料与葡聚糖支架的共价结合限制了商业链霉亲和素试剂所提供的灵活性（例如，市面上存在多种多样化的荧光染料-链霉亲和素结合物）。

图1 右旋糖酐掺杂策略在右旋糖酐聚体组装中的设计与优化。

这里，描述了一种简单且低成本的制备dextramer的方法。链霉亲和素-荧光染料与亚化学计量数的生物素标记的pMHC或生物素标记的TCR结合，从而保留部分链霉亲和素位点用于结合额外的生物素基团。然后将生物素标记的高分子量右旋糖酐加入结合反应中，从而组装成高价位的dextramer。证明了所获得的pMHC dextramer或TCR dextramer可用于检测和监测低亲和力（肿瘤）抗原反应性T细胞亚群，或用于研究抗原呈递过程。

设计了一种简单的策略来制备pMHC右旋糖酐复合物：利用链霉亲和素-荧光染料与少量生物素标记的pMHC分子结合，随后通过其剩余的开放结合位点，在生物素化的右旋糖酐骨架上进行进一步组装（图1A）。相较于现有的pMHC-右旋糖酐复合物制备方法，这种右旋糖酐掺杂策略具有多个优势。首先，它成本低廉，仅使用市面上可购买的试剂以及可自行制备或从NIH四聚体核心实验室免费获取的生物素标记单体。其次，链霉亲和素和荧光染料并未直接共价连接到右旋糖酐核心上，因此右旋糖酐掺杂策略可与市面上多种链霉亲和素-荧光染料偶联物配合使用。结合紫外线介导的肽交换技术和多维组合编码技术，右旋糖酐掺杂法可构建用于同时检测多种低亲和力T细胞特异性的pMHC dextramer复合物。第三，这一通用策略还可用于使其他具有研究价值的分子（例如TCR）多聚化，从而制备目前市面上尚无法获得的检测试剂，研究抗原呈递。

为了优化右旋糖酐复合物的组装方案，改变了每个荧光链霉亲和素分子所对应的生物素标记的pMHC（HLA-A2/MART1-ELAGIGILTV）分子的比例，并在其中掺入了不同当量的生物素标记的右旋糖酐。随后，检测了所获得的试剂对表达对应TCR（A2/MART1特异性的M1和F5）或非对应TCR（A2/NYESO1特异性的1G4）的HEK 293T/17细胞进行标记的能力（图1B）。从本实验中可以得出四个结论。首先，与传统的四聚体染色相比，掺入右旋糖酐后，对应TCR表达的HEK 293T/17细胞的标记强度有所增加。其次，对于低亲和力的M1 TCR，四聚体与不同右旋糖酐复合物之间的染色强度差异（5.5-11.7倍）比高亲和力的F5 TCR（2.5-3.8倍）更大。第三，A2/MART1四聚体及所有右旋糖酐复合物均未与非对应1G4 TCR转染的HEK 293T/17细胞结合，表明右旋糖酐掺入并不影响结合的特异性。最后，不同右旋糖酐复合物之间的染色强度变化不大（<2倍），表明右旋糖酐掺入带来的高结合力使染色强度对于每个链霉亲和素分子所结合的生物素化pMHC数量不敏感。尽管如此，仍确定3:1::pMHC:链霉亲和素以及0.05:1::右旋糖酐:链霉亲和素的比例为右旋糖酐复合物组装的最佳比例。

接下来，评估了通过葡聚糖掺杂制备的右旋糖酐四聚体在细胞染色中的效率和特异性。根据上述优化的方案制备了小鼠H-2Kb/Ova右旋糖酐四聚体，并用不同稀释度的四聚体对表达同源TCR（H-2Kb/Ova特异性的OTI）或非同源TCR（F5）的HEK 293T/17细胞进行染色（图1C）。结果显示，H-2Kb/Ova葡聚糖染色具有特异性和可滴定性，表明葡聚糖掺杂技术可用于小鼠pMHC多聚体的制备。发现由葡聚糖掺杂制备的葡聚糖染色的最佳稀释比例为1:200至1:50，其染色强度与市售H-2Kb/Ova葡聚糖染色相比相当甚至更优。为了比较非特异性背景染色，使用自行制备或从Immudex公司购买的A2/MART1和A2/NYESO1葡聚糖染色对原代人CD8+ T细胞进行了染色。自行制备的葡聚糖染色与市售葡聚糖染色相比，其背景染色未显著升高（A2/MART1葡聚糖，0.11±0.02% vs. 0.06±0.07%，P=0.31；A2/NYESO1葡聚糖，0.24±0.18% vs. 0.02±0.04%，P=0.17）。

右旋糖酐聚合体的简便组装方法对于肿瘤免疫学和免疫治疗领域将特别有用。II类pMHC分子的右旋糖酐聚合体能够改善对抗原特异性CD4+ T细胞的检测效果，这类细胞正逐渐被认识到是抗肿瘤免疫的重要组成部分，并且其亲和力通常低于CD8+ T细胞。此外，来源于肿瘤反应性CD8+ T细胞的TCR受胸腺选择限制，其亲和力普遍处于较低范围，并且通常需要CD8与MHC I类分子的相互作用来辅助识别pMHC。利用对A2/MART1具有不同亲和力的TCR转导PBMC，以评估右旋糖酐掺杂在何种程度上能够改善低亲和力和高亲和力TCR在CD8+或CD8- T细胞上的pMHC多聚体染色效果。A2/MART1右旋糖酐聚合体未与非特异性1G4 TCR转导的T细胞结合，这证实了这些试剂在原代T细胞染色中的特异性（图2A）。相比之下，与四聚体相比，右旋糖酐聚合体改善了针对特异性TCR转导T细胞的抗原特异性染色效果。这种改善的程度从CD8+ T细胞上高亲和力TCR的2.4倍提高到CD8- T细胞上低亲和力TCR的5.7倍，后者甚至无法通过四聚体染色从背景信号中区分出来。

图2 右旋糖酐掺杂提高了低亲和力/肿瘤反应性T细胞的检测。

利用可进行UV交换的肽配体组装多重pMHC四聚体组的能力，是表征和分离肿瘤特异性T细胞的一项重要进展。为了确定葡聚糖掺杂是否能够将pMHC葡聚糖复合物的灵敏度优势与pMHC紫外线交换技术结合，制备了与可进行UV交换的肽结合的生物素化HLA-A2单体，在MART1或NYESO1肽存在下对单体进行照射，并使用交换后的单体制备四聚体或掺杂葡聚糖的葡聚糖复合物，随后用这些多聚体染色TCR转导的Jurkat T细胞。与传统多聚体染色原代CD8- T细胞的结果类似（图2A），经紫外线交换的葡聚糖复合物对F5 TCR转导的CD8- Jurkat T细胞染色的MFI比经UV交换的四聚体高出3.2倍（图2B）。结合依赖于MART1配体的UV交换，而对转导非对应TCR的细胞则未观察到结合。因此，葡聚糖掺杂可以与pMHC紫外线交换技术结合，用于制备具有与UV交换四聚体相当的特异性且灵敏度更高的多聚体组合。

为了确定掺入葡聚糖的dextramer是否能够改善对参与内源性抗肿瘤免疫的T细胞的检测效果，使用四聚体或dextramer对一名黑色素瘤患者的PBMC进行了染色分析。此前的研究已对该患者的外周TCR库进行过表征，发现其中含有约5%频率的MART1特异性T细胞。虽然使用传统四聚体能够检测到MART1特异性T细胞，但通过加入葡聚糖，染色信号增强了2.6倍（图2C）。使用掺葡聚糖的dextramer染色的效果与商业dextramer相当，表明在检测低亲和力T细胞方面，葡聚糖掺入技术具有与商业dextramer相近的效果，同时还能显著节省成本。

右旋糖酐掺杂是一种通用方法，可用于增加任何生物素化分子的非共价多聚化。此前的研究结果显示，TCR tetramer能够实现对呈递同源抗原的靶细胞进行特异性和定量染色、竞争性阻断T细胞介导的免疫应答，并可能用于抗原导向的药物递送。多聚化的TCR还可用于研究TCR交叉反应性，并为orphan TCR发现肽配体。因此，制备了TCR dextramers--以确定提高试剂的多价性是否可促进上述应用。TCR右旋糖酐复合物通过右旋糖酐掺杂方式制备，原理类似于pMHC右旋糖酐复合物的制备方法（图3A）。

为了确定TCR dextramer是否能够特异性地染色呈递同源抗原的目标细胞，将HLA-A2导入人红白血病细胞系K562，随后用NYESO1或MART1肽段对衍生细胞系进行脉冲处理，并用NYESO1特异性的1G4 TCR多聚体或MART1特异性的F5 TCR多聚体对肽段脉冲处理的细胞进行染色。TCR多聚体能够特异性地染色与其同源肽段脉冲处理过的细胞（图3B）。对于所测试的两种特异性识别作用，TCR dextramer的染色效果优于TCR tetramer（F5 TCR提高7.9倍，1G4 TCR提高2.9倍）。Dextramer染色具有定量性，随着脉冲肽段用量的减少，染色信号也逐渐减弱（图3C）。当肽段浓度降至2μM时，dextramer信号迅速减弱，在0.4μM及以下浓度时已无法检测到。在这些低肽段浓度下，细胞表面同源pMHC靶标的密度已过低，无法实现多价结合，因此TCR dextramer的应用受到限制。重要的是，这些脉冲肽段浓度所导致的细胞表面肽段呈递水平，很可能远高于内源性抗原加工所产生的肽段水平。事实上，曾尝试使用F5 TCR dextramer检测黑色素瘤细胞中内源性呈递的MART1抗原，但未获成功。因此，对于需要检测或靶向内源性表达抗原的应用而言，无论价态如何，亲和力优化的可溶性TCR试剂均比多聚化的TCR试剂更为适用。

图3 TCR右旋糖酐复合物可增强抗原特异性靶细胞的结合能力。

尽管TCR dextramers无法检测内源呈递的抗原，但它们可能在与抗原加工相关的特定研究中发挥作用。例如，之前的一项研究描述了一种现象，即在靶细胞表面，携带不同肽段的I类pMHC分子存在分离性聚集。这种肽特异性的pMHC聚集需要内源性表达（即在外部添加肽的情况下未观察到），并且发生在转运至细胞表面之前（即在高尔基体中即可检测到）。然而，尚不清楚聚集是在抗原加工的哪个阶段开始的，也未确定这种聚集是否依赖于蛋白酶体加工或由TAP介导进入内质网的过程。单链三聚体（SCTs）是一种合成构建体，它通过基因手段将特定肽段连接到b2m以及I类MHC重链上，形成一条单一的多肽链。由于这种连接方式，SCT在细胞表面的表达绕过了蛋白酶体加工和肽装载过程。此外，由于这些分子能够确保每一个表达在细胞表面的SCT都携带编码的肽段，推测它们的密度足以与多价TCR试剂形成稳定的结合。因此，可以利用TCR dextramers来研究SCTs是否也像pMHC一样，以肽特异性的方式在靶细胞表面发生聚集。

首先确定TCR dextramers是否能够检测靶细胞表面的SCT。用A2/MART1 SCT、A2/NYESO1 SCT或者两者同时转导K562细胞，并通过流式细胞术检测这些衍生细胞系与F5和1G4 TCR dextramers的结合情况。正如预期，未转导的细胞不能与任何一种TCR试剂结合，仅表达一种SCT的转导细胞只与对应的TCR试剂特异性结合，而同时表达两种SCT的转导细胞则能与两种TCR试剂结合（图4A）。随后，采用全内反射荧光（TIRF）显微镜来研究这些SCT分子在K562细胞表面的聚集情况。与流式细胞术结果一致，未转导的细胞不与任何TCR试剂结合，而仅表达一种SCT的细胞只与对应的TCR结合（图4B）。有趣的是，同时转导两种SCT的细胞表现出明显的A2/MART1和A2/NYESO1 SCT分子聚集区域，这一点通过1G4和F5 TCR dextramers结合信号之间缺乏重叠得到了证实（图4C）。该结果的重要性体现在两个方面。首先，由于SCT绕过了蛋白酶体加工、TAP介导的向内质网转运以及MHC分子的肽段装载过程，数据表明pMHC分子的肽段特异性聚集可以独立于这些过程发生。其次，要明确调控pMHC聚集的规律，就需要对许多不同肽段进行成对的聚集分析；如果每种被测试肽段都需要对应的可溶性TCR试剂，则这一分析将面临巨大挑战。SCT可能有助于推动这一研究，因为特定肽段与MHC分子之间的遗传连接关系避免了对可溶性TCR的需求（例如，使用针对表位的抗体可以分辨携带不同肽段的表位索引SCT）。

图4 TCR dextramers可检测pMHC单链三聚体（SCT）的肽特异性聚集情况。

这里介绍一种简便的方法，通过用亚化学计量的生物素化单体与链霉亲和素-荧光染料结合物进行组装，随后在组装反应中掺入高度生物素化的葡聚糖支架，从而制备pMHC和TCR葡聚糖复合物。与市售的葡聚糖复合物类似，这种掺入葡聚糖的复合物相对于pMHC四聚体，提高了对抗原特异性T细胞检测的灵敏度。与市售葡聚糖复合物相比，这种方法具有以下优势：①成本低廉；②易于在生物学或免疫学实验室环境中采用；③与先进的技术（例如UV介导的肽交换和多维组合编码技术）兼容，能够同时监测多个抗原特异性T细胞亚群；以及④适用于其他尚无市售葡聚糖复合物的生物素化分子（如TCR）。这些试剂与市售葡聚糖复合物共有的缺点有两个方面。首先，它们依赖于高亲和力结合，无法稳定地结合低密度的靶标分子。对于内源装载的pMHC检测，需要使用更高亲和力的试剂，例如亲和力成熟的TCR或类似TCR的抗体。其次，每个葡聚糖分子所结合的pMHC和荧光染料分子数量无法严格控制。对于高度量化的研究，采用分子结构明确的试剂可能更为合适。尽管存在这些局限性，这里提出的方法仍有助于开展需要高阶多价pMHC或TCR复合物的半定量研究。作为示例，展示了pMHC dextramers可用于从外周血中检测抗肿瘤反应性T细胞，以及TCR dextramers可用于深入了解MHC I类分子介导的抗原呈递过程。

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