从实验室到医疗，分体RNA开关的无限可能

2025年7月，Nature Communications在线发表了"Split RNA switch orchestrates pre- and post-translational control to enable cell type-specific gene expression"一文，旨在开发一种名为"Split RNA Switch"的新型基因调控技术，通过整合多个 RNA开关的输出信号，并利用蛋白质剪接（protein splicing）机制，实现对目标基因表达的精确调控。

文章亮点

1. ON/OFF比升高25-45倍

"Split RNA开关+漏表达抑制子"将背景噪音压到原来1/25甚至1/45，首次仅靠合成mRNA实现抗生素筛选纯化。

2. 一张mRNA"拼图"兼容多种功能

荧光蛋白、抗生素耐药基因、Cas9等均可剪成两段再合体，验证了该mRNA平台即插即用，几乎适配所有下游效应蛋白。

3. 细胞可编程的生物逻辑电路

用两套正交 split intein，搭建出能同时识别三种 miRNA 的"三输入逻辑门"，为复杂细胞亚群精准分类提供新工具。

1、分裂式RNA开关实现基因精确调控

首先将目标蛋白如CRISPR-Cas9拆分为N端/C端片段，分别连接分裂内含肽（split intein）。当这两个片段在细胞内同时存在时，split intein 会催化这两个片段的连接，形成完整的功能性蛋白。

然后设计了两种类型的RNA开关--ON开关和OFF开关。ON开关在目标 miRNA 存在时促进目标蛋白的表达，而OFF开关在目标miRNA存在时抑制目标蛋白的表达。

将 N-端和C-端蛋白片段分别编码在两个ON开关中，并引入一个编码突变C-端片段的OFF开关作为"漏表达抑制子"，当 miRNA 阴性细胞中 ON 开关少量漏表达 N - 端片段时，OFF 开关表达的突变 C - 端片段会与之结合形成无功能产物，从而在 miRNA 阴性细胞中有效抑制背景噪音。

图1. ON开关和OFF开关示意图

2、多场景实验验证Split RNA Switch性能

（1）研究人员首先在 HEK293FT 细胞中测试了 Split RNA Switch 的性能。他们使用 miR-21-5p 作为目标 miRNA，通过流式细胞术和荧光显微镜定量分析了荧光蛋白 hmAG1 的表达水平。

结果显示，Split RNA Switch 系统在 miRNA 阳性细胞中显著提高了荧光蛋白的表达，而在 miRNA 阴性细胞中则抑制了背景噪音，使 ON/OFF 比例从单开关的 3 倍提升至 25 倍以上。

图2. 加入漏表达抑制子ON/OFF 比提升至25倍以上

（2）研究人员进一步验证 Split RNA Switch 在控制抗生素耐药基因（如 PAC、HPH 和 BSR）表达方面的应用。

通过在 HeLa细胞中引入 Split RNA Switch 系统，并在不同条件下培养细胞，他们发现该系统能够有效区分 miRNA 阳性和阴性细胞，实现细胞类型特异性的抗生素耐药性，成功在HeLa/HEK293FT混合群里把目标细胞纯度从58%拉到96%。

图3. Split RNA调控耐药基因，在HeLa细胞中存活率>80%

3、多输入逻辑门多重验证细胞身份

研究人员利用 Split RNA Switch 系统构建了多种两输入逻辑门，通过组合不同的 miRNA 响应开关，实现了对多种 miRNA 信号的同时检测和逻辑运算。此外，还利用两套正交的 split intein，成功构建三输入逻辑门，实现了对三种 miRNA 信号的同时检测和逻辑运算。

图4. 构建的两输入（左）、三输入（右）生物逻辑门电路结构

总结与展望

Split RNA开关系统通过"剪-拼-中和"三步走，一举解决漏表达和标记缺乏两大痛点，仅用mRNA递送即可实现高特异性的细胞纯化、基因编辑、安全自杀功能，适配现有脂质体、LNP等mRNA平台。

未来，逻辑门版本可扩展至任意数量输入，有望像"细胞GPS"一样在复杂组织中导航治疗。但仍需注意：漏表达抑制子可能轻微降低 ON 状态活性，RNA 递送效率需优化以适应体内场景，提升逻辑门响应速度，推动技术向临床转化。