肠道固有层免疫细胞分离制备指南

1、实验前准备

试剂准备

40% Percoll溶液配制：

Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按体积比4:6混合，配制40%等渗Percoll溶液。

80% Percoll溶液：

Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液。用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按体积比8:2混合，配制80%等渗Percoll溶液。

2、肠道固有层免疫细胞分离步骤操作步骤

1）颈椎脱臼法处死小鼠并固定在手术台上，75%酒精消毒小鼠腹部，于正中纵行剪开暴露腹腔；

2）如下图所示，在小鼠胃与十二指肠连接处剪断，一边分离小肠周围脂肪组织和肠系膜，一边拉出小肠，之后在小肠和盲肠连接处剪断，从而分离出小肠。

小鼠肠道组织解剖图

3）10cm培养皿中加入5mL 4°C预冷的PBS，将步骤2中的小肠放入培养皿润洗，使用镊子和剪刀依次去除脂肪组织和派伊尔结。

小鼠派伊尔结去除操作图

A. 去除表面脂肪和肠系膜等组织的小肠，红色箭头指示派氏结（平均每只小鼠有6-9个派氏结）；

B. 剪去派氏结的操作示意图；

C. 去除派氏结后的小肠，红框是所有剪下来的所有派氏结。

小鼠派伊尔结(Peyer's patches, PPs)是小鼠肠道黏膜免疫系统的重要组成部分，主要分布在小鼠小肠的下部，即远端空肠和回肠，与小鼠固有层免疫细胞的组成和功能有显著差异，在分离小鼠肠道免疫细胞时，去除派伊尔结是为了确保获得更纯净、更具代表性的目标细胞群体，从而提高实验结果的可靠性。

4）将小肠切成4段，用剪刀纵向剪开小肠（不必沿着肠系膜方向），暴露出肠内容物，轻轻地将肠内容物从粘膜表面刮除；

5）将小肠转移到含有10mL HBSS + 2%FBS的50mL离心管中，剧烈涡旋10-20s；

6）用镊子取出小肠重复清洗2次；

7）将清洗过的肠组织，剪碎成0.5cm的小片段，将组织块(100-200mg)转移到2mL圆底管中，加入1mL小鼠肠道组织解离液，37°C水平摇床轻轻摇晃孵育60min（根据组织糜烂状态适当延长孵育时间）；

8）从水平摇床中取出圆底管，剧烈涡旋10-20s，通过70μm细胞筛网过滤，用10mL PBS冲洗细胞筛网；

9）收集含有细胞的滤液到50mL管中，20°C下400g离心5min，弃上清液，用 4 mL 40% percoll重悬细胞沉淀并转移到 15 mL 离心管；

10）吸取 2.5 mL 80% percoll 深入到 15 mL 离心管底部，试管稍微倾斜，将 4 mL 40% percoll 与细胞的混合液沿着管壁缓慢加入离心管，覆盖在 80% percoll 溶液的顶部形成密度梯度；

▲ 注意：不要破坏 80% percoll 和 40% percoll 与细胞的悬浮液的分界面，40% 和 80% percoll 现配现用。

11）800 g 20 °C 离心 20 min，升速（ACC）1，降速（DEC）1；

Percoll 分离组织免疫细胞示意图

注：分离图片参考自文献 DOI: 10.21769/BioProtoc.1010327

12）离心结束后，吸取中间白膜层免疫细胞至新的 15 mL 离心管中，加入 3 倍体积 4°C 预冷 PBS，上下颠倒混匀，4 °C 下 400 g 离心 5 min，弃上清；

13）按照步骤 12 重复清洗一次，弃上清得到肠道固有层淋巴细胞；

14）细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至 5-10×10^6 cells/mL，将 100 μL/管的细胞悬液分配到 12×75 mm 的流式管中用于后续实验操作。

3、流式实验结果图