从TCR组库中分析筛选癌症免疫治疗的治疗性TCR

在过去10年中，众多创新的免疫治疗策略改变了癌症的治疗方式，并改善了对传统化疗和放疗无反应的患者的生存状况。免疫检查点抑制方法旨在阻断限制内源性T细胞功能的负向调控通路，而过继细胞疗法则产生具有高功能性和明确癌症特异性的治疗性T细胞。虽然CAR工程技术成功地靶向了癌症表面抗原，TCR工程技术则能够靶向整个癌症蛋白质组，包括突变的新抗原。迄今为止，TCR工程技术主要集中在识别被明确表征的治疗性TCR所识别的目标癌症抗原。这里，英国伦敦大学Hans J. Stauss教授团队探讨了以抗原为重点的方法是否可以与以TCR为重点的方法相辅相成，即个体患者的TCR库信息为选择用于过继细胞疗法的TCR、以改造自体T细胞提供了依据。讨论了如何利用TCR克隆性特征、T细胞亚群中的分布情况，以及不断改进的TCR数据库进行生物信息学筛选，从而指导治疗用TCR的选择。还概述了体外筛选方法，用于优先选择TCR候选者，以确认其对癌症的反应性并排除对健康自体细胞的识别能力，即使在目标抗原尚未明确的情况下，这种方法也可为其治疗应用提供验证依据。

早期关于免疫系统在肿瘤控制中重要性的临床前研究发现，具有免疫缺陷的小鼠更容易发生自发性和致癌物诱导的癌症，而临床研究也观察到在如艾滋病或器官移植后免疫抑制等情况下，免疫缺陷患者的癌症发病率升高。20世纪80年代后期，概念验证研究表明，调动免疫系统可以带来抗肿瘤的治疗益处，其中包括回输在体外扩增的TILs治疗转移性黑色素瘤患者的开创性试验，该试验显示了良好的疗效。20世纪80年代的早期临床试验还表明，给予T细胞刺激性细胞因子IL-2可导致黑色素瘤和肾细胞癌患者出现肿瘤退缩。而2010年代初的里程碑式临床试验则证实，阻断T细胞抑制性检查点分子CTLA-4和PD-1的单克隆抗体可显著改善多种癌症类型的生存率。

这些研究共同表明，存在一个内源性的T细胞库，这些T细胞能够特异性识别癌细胞，并且在数量扩增、功能增强或解除抑制后，可以有效清除肿瘤。因此，尽管这种观点较为简单，但目前一个主流的观点是根据免疫活动的程度将肿瘤分为"热"肿瘤或"冷"肿瘤。其中，"热"肿瘤是指被T细胞浸润的肿瘤，包括黑色素瘤、膀胱癌和NSCLC，这些肿瘤对调动免疫系统的治疗方式表现出较好的响应；而"冷"肿瘤则缺乏具有功能的免疫细胞浸润，例如GBM、胰腺癌或前列腺癌，这些肿瘤通常对治疗不敏感。根据肿瘤免疫浸润情况将其分为"热"或"冷"，可预测在接受治疗前T细胞浸润水平高、T细胞亚群组成良好以及表型有利的癌症患者具有更好的预后。

在这里，将探讨一个工作假说：肿瘤浸润性T细胞的TCR库中包含与癌症患者预后相关的信息，而且更重要的是，即使所鉴定出的TCR的肽段特异性仍未知，仍有可能筛选出特定的TCR，用于癌症治疗中经基因工程改造的自体T细胞疗法。

癌症免疫中的T细胞

在过去的20年中，肿瘤学的治疗选择因一系列全新的免疫疗法而发生了真正的变革。许多免疫疗法可以被视作前体药物，它们最终都会转化为一种有效的活性药物产物，即具有抗肿瘤功能的T细胞（图1）。过继细胞疗法包括体外扩增的TIL输注，该疗法2024年2月已获得美国FDA批准，用于治疗无法切除或转移性黑色素瘤；还包括通过改造TCR来改变T细胞对癌症抗原特异性的T细胞转移疗法。

图1 癌症免疫治疗中的T细胞激活方式。展示了直接或间接作用于抗肿瘤T细胞激活的免疫激活方式。在过继性T细胞治疗中，通过转导或电穿孔使患者来源的T细胞表达针对肿瘤蛋白的CARs或TCRs，随后将这些T细胞过继转移给患者。在TIL治疗中，从手术切除组织中获取TIL，在体外扩增后重新输注给患者。免疫检查点抑制治疗通过提供单克隆抗体阻断抑制性受体，包括CTLA-4、PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3和TIGIT，从而解除对内源性T细胞的功能抑制。同样，TCE是一类双特异性分子，包含一个结合CD3的结构域和一个针对癌症靶点的结合结构域，这两个结构域可以是来自scFv的传统双特异性分子，也可以是来自TCR的ImmTACs，从而实现对内源性T细胞的局部招募和激活。最后，治疗性癌症疫苗以mRNA、肽或负载肿瘤抗原的DC细胞形式，旨在启动或增强内源性肿瘤特异性T细胞反应。

目前占据主导地位的是CAR-T细胞，主要靶向CD19和BCMA等B细胞系抗原。这种疗法在血液系统恶性肿瘤中展现出令人瞩目的临床缓解效果，但在实体瘤治疗方面尚未取得类似的突破。CAR是一种合成受体，其结构包含来源于抗体scFv的抗原结合域，这使得CAR只能识别细胞表面的靶点。这些结合域与胞内信号传导结构域相连接，通常包括CD3ζ以及一个或多个共刺激分子，例如CD28和4-1BB。相比之下，经过改造的TCR-T细胞能够识别由MHC分子呈递的细胞表面及细胞内抗原，从而提供更广泛的抗原覆盖范围，包括细胞内的癌蛋白组和新抗原，因此可以克服CAR-T细胞疗法的一些局限性。TCR-T细胞近年来受到了广泛关注，2024年8月美国FDA批准了afami-cel疗法，该疗法靶向MAGE-A4，用于治疗转移性滑膜肉瘤患者，标志着TCR-T细胞疗法的重要进展。

TCRs调控T细胞功能

T细胞的特异性由其表面的TCR所决定，TCR通过与MHC分子呈递的短肽结合来实现抗原识别，人体中MHC被称为HLA。在胸腺中，通过TCRα/β基因片段的随机重排，并伴随连接多样性产生，形成庞大且克隆分布的TCR库，随后经历阳性选择和阴性选择，最终产生具有高度多样性的TCR库，这些TCR能够耐受自身抗原并识别非自身抗原。

从结构上看，TCR是一种由二硫键连接的α和β链组成的异源二聚体受体，并且非共价结合CD3εγδζ链，后者对于TCR在细胞表面的表达以及胞内信号传导至关重要。通过其高度可变的CDR，CD8+和 CD4+ T细胞所表达的TCRαβ分别与MHC-I类（HLA-A、B、C）和MHC-II类（HLA-DR、DP、DQ）呈递的短肽相互作用。其中，MHC I类分子呈递的肽段主要来源于细胞核、胞浆以及细胞表面所表达的蛋白质，而MHC II类分子呈递的肽段则主要来自存在于细胞外环境中的蛋白质。因此，MHC I类限制性的 CD8+ T 细胞能够识别靶细胞整个蛋白质组来源的肽段，而MHC II类限制性的CD4+ T细胞则主要识别来源于微环境中的蛋白质肽段，包括来自死亡肿瘤细胞释放的蛋白片段。

TCR识别的癌症靶点

TCR能够识别多种类型的肿瘤抗原，包括来自EBV、HBV和HPV等致癌病毒的病毒抗原、由肿瘤特异性突变产生的新抗原，以及TAA，例如癌-睾抗原和组织特异性分化抗原。这些抗原作为治疗靶点的优缺点已在其他文献中得到广泛讨论。总的来说，具备免疫原性、肿瘤特异性和致癌相关性等关键标准的可治疗性抗原靶点较为有限。除了传统的蛋白质编码序列之外，越来越多的研究开始关注"暗蛋白质组"来源的抗原，包括源自内源性逆转录病毒和可移动遗传元件的肽段、异常剪接变体、移码突变产物、环状RNA以及微生物来源的抗原。这些抗原均在细胞内被加工，并通过MHC呈现在细胞表面，从而扩展了具有治疗潜力的TCR靶点的可能范围。

TCR免疫治疗开发中的一个主要瓶颈在于难以特异性地识别针对肿瘤的反应性TCR，特别是因为绝大多数TCR仍属于"orphan"受体，其抗原特异性尚不明确。因此，人们越来越感兴趣于从以抗原为中心的发现模式转向以TCR为中心的框架，重点分析肿瘤微环境（TME）中TCR的组成、多样性和克隆动态，以此作为免疫活性和治疗应用的替代指标，即使所选TCR的肽特异性仍不清楚。

TME中TCR组成与多样性的研究进展

如上所述，TILs的数量和组成是癌症患者的预后指标。利用数字病理学进行定量评估一致表明，CD4+和CD8+细胞数量较多与较好的预后相关。结合基因表达谱分析以及包括B细胞、NK细胞和髓样细胞在内的其他细胞类型的分析，可以进一步明确特定T细胞表型特征和整体细胞环境如何相互作用以促进有效的抗肿瘤反应。了解肿瘤中保护性和非保护性T细胞反应驱动因素的一个重要工具是对TCR多样性和克隆扩增的分析。除了在抗原识别中的机制性作用之外，TCR还作为一种独特的分子条形码，使得能够对单个T细胞克隆进行精确的空间和时间追踪，并推断T细胞在肿瘤中的活性情况。

TCR多样性与克隆分布的指标

分析TCR库组成和分布的重要指标包括多样性指数和克隆性指数，它们的数学定义源自生态学和信息学领域。

库容丰富性反映了唯一TCR序列的数量，而库容均匀性则涵盖了TCR序列克隆丰度的不均衡性。常用的TCR多样性指标，如Shannon和Simpson多样性，同时考虑了丰富性和均匀性（图2），因此对于表现出不均匀寡克隆扩增的库容，会得出较低的多样性评分。Simpson多样性对克隆优势的敏感性高于其他多样性指标，因此特别适用于检测肿瘤浸润库容中潜在的寡克隆扩增情况。

图2 TCR库中丰富度和均匀度多样性指标的示意图。展示的两个TCR库具有相同的丰富度，各自均包含5种独特的克隆型，用饼图中不同颜色的扇区表示。尽管丰富度相同，左侧的库具有更高的均匀度，其中所有克隆型在库中所占比例相同（各占20%）；而右侧的库均匀度较低，由一种扩增的克隆型主导，并包含其他频率不均的克隆型。像Simpson和Shannon多样性这样的指标能够直观地反映出均匀度较低的库多样性也较低这一概念。

衡量多样性指标时，一个重要的注意事项是，这些指标可能会受到取样深度变化的干扰，即每个样本中捕获并测序的TCR序列总数。当取样深度不足时，可能会遗漏低频率的克隆型，从而低估多样性。通过计算方法将各个组库的取样量统一到相同规模，有助于解决这一问题，此外，使用如Simpson多样性指数等具有无偏估计器的指标也是一种可行的方法。

最后，诸如Jaccard指数之类的重叠指数可以测量TCR库之间的相似性，这在比较治疗前后、不同组织区室之间甚至不同患者之间的TCR库时非常有用。那些对克隆扩增最显著的TCR变化敏感的指数，可能特别适合捕捉驱动主导性抗肿瘤反应的免疫事件。

尽管存在多种用于量化多样性的指标，但该领域对于肿瘤中TCR多样性的预后价值仍缺乏明确的共识。较高的TCR多样性可能反映了一个能够识别肿瘤抗原的广泛TCR克隆库，而某些TCR的克隆优势可能表明肿瘤反应性T细胞的扩增。此外，如果某些克隆型针对的是次优势肿瘤抗原，其扩增水平可能较低，但仍可能成为免疫治疗的有效靶点。

治疗前后TCR克隆性的预测能力

在近200名原发性黑色素瘤患者的队列中，校正肿瘤厚度和患者年龄等因素后，肿瘤内TCRβ链基线Simpson克隆性无法区分疾病进展者和非进展者。同样，在转移性黑色素瘤患者接受TIL治疗的背景下，基线肿瘤的整体TCR丰富度和均匀度也无法区分治疗应答者与非应答者。该研究显示，相比整体的多样性指标，最有意义的变量是基线时具有实验确认肿瘤反应性的CD8+克隆数量，以及最终制备的用于回输的TIL产品中保留的这些优势克隆的数量，这决定了最终TIL产品中肿瘤反应性克隆的绝对数量。

在多项病例报告和观察性研究中，也评估了免疫治疗前后T细胞组成和多样性变化。PD-1阻断治疗可增加黑色素瘤患者肿瘤内部增殖（Ki67+）的CD8+ T细胞数量，其中治疗有效的患者还表现出整体丰富度较低、克隆性更高，即治疗后扩增的克隆数量更多；在肺癌患者外周血中也观察到了类似结果。在基底细胞癌（BCC）或鳞状细胞癌（SCC）患者中，耗竭型CD8+ T细胞的克隆库在PD-1治疗后基本被新的克隆所取代，这表明动员那些在治疗前肿瘤中并不存在的、高度扩增的新特异性克隆具有重要意义。

血液与肿瘤之间的TCR共享

值得注意的是，最近的研究显示外周血与肿瘤组织中TCR克隆频率存在显著差异。这意味着一方面，PBMC中的TCR序列未必能可靠地反映TME中发生的免疫事件；但另一方面，这也提供了一种策略，即通过检测在肿瘤组织中相较于外周更明显扩增的TCR克隆，来识别具有肿瘤反应性的克隆。尽管克隆扩增是用于评估对肿瘤抗原增殖反应的一个有用指标，但这种方法并不完美，因为它可能反映的是局部组织中存在的肽段所引发的反应，或由细胞因子介导的非抗原特异性扩增。因此，应尽可能在具备邻近非肿瘤组织对照的情况下进行分析。

患者间共享的公共TCR应答

TIL来源的TCR大多是高度私有的，由于重排的随机性以及每个个体不同的体细胞突变和HLA类型，这给治疗转化带来了重大挑战，因为大多数TCR仅存在于个别患者中。

尽管两个个体通过随机重组事件产生完全相同TCR序列的先验概率较低，但已有多个研究报告指出，在多种癌症类型中存在个体之间共享的"公共"TCR或TCR基序。在对EBV驱动的鼻咽癌（NPC）与非病毒性头颈鳞状细胞癌（NSCC）进行比较分析时，研究人员发现少量TCRβ克隆重叠，并报道这两种癌症类型均包含"公共"克隆型（即患者之间共享的克隆型），但这些克隆型仅限于各自的癌症类型。总体而言，这些数据表明，公共TCR的出现可能是由于存在共有的、癌症特异性的抗原印记，并暗示了利用公共TCR作为探针来检测常见的抗原驱动因素的潜力，这些抗原很可能是公共的TAAs，而非个体特异性的癌症新抗原。

TCR Meta-克隆型

最近引入了"元克隆型"（meta-clonotypes）这一概念，用于归类结构相似、且推测具有相同抗原特异性的TCR（图3）。与传统通过完全相同的核苷酸序列定义的克隆型不同，元克隆型将具有高度相似的CDR3序列、共有基序或相似生化特征的TCR聚类在一起。这里的生化特征指的是CDR3某一位置上氨基酸的生化特性，而非仅仅是氨基酸本身，例如疏水性。这种方法有助于研究"公共"T细胞应答，因为它克服了精确序列匹配出现概率较低的问题。

图3 TCR元克隆型的示意图。TCR元克隆型是一组具有高度序列相似性，或共享序列和结构基序的TCR集合，这些TCR被认为具有相同的抗原特异性。"中心"TCR被展示出来，周围是与中心TCR在不同编辑距离（∆ = 1、2、3个替换）下的同心环状TCR序列，并根据编辑距离进行颜色编码。编辑距离可以通过比较TCRα序列、TCRβ序列或两者来计算，通常使用Levenshtein距离，这是一种量化字符串序列差异的指标。具有实验确定抗原特异性的TCR（以灰色边框表示）可能包含不同编辑距离的TCR，而这并不一定与替换数量相关。

尽管具有高度相似的TCR序列，属于同一TCR元克隆型家族的成员在肿瘤中可能表现出不同的表型特征和命运。例如，在一项针对接受抗CTLA-4和抗PD/PD-L1治疗的NSCLC的纵向研究中，通过高度相似的TCRβ链鉴定出的元克隆型经单细胞RNA测序分析显示，它们来源于不同表型的细胞簇，并且在免疫检查点阻断治疗过程中表现出不同的扩增和收缩动态。

重要的是，免疫反应若能在一个meta-clonotype内部募集一组高度相关的TCR，被认为可以提供更强大且持久的保护。这种功能性冗余不仅能够抵御因表位突变导致的抗原逃逸，还能在T细胞功能障碍或克隆缩减的情况下提供适应力。预测，针对某一特定肿瘤抗原具有反应性的TCR meta-clonotype成员将展现出不同的TCR亲和力，这种差异可能会影响T细胞反应的动力学特征及其特性。

因此，量化元克隆类型内的广度和克隆结构有望成为有效抗肿瘤免疫的生物标志物，并可能为基于TCR的诊断和治疗的合理设计提供依据。

哪些T细胞亚群存在克隆扩增？

携带克隆扩增的TCR的T细胞表型涵盖不同的亚群，最常见的是具有效应记忆或耗竭表型的抗原经受群体，其特征包括LAG3、TIGIT、PDCD1、TIM-3和CTLA-4等标志物。这一关联强调了T细胞的表型和功能状态对于解释克隆扩增和识别肿瘤特异性反应的重要作用。

在一项整合了23,000多种TCR克隆型的研究中（涵盖多种转移性癌症类型），发现，大多数TCR克隆都是单例克隆（即在样本中仅出现一次的独特TCR），占比达83%。同时，寡克隆扩增主要集中于功能失调、驻留记忆和效应记忆T细胞簇中，而这些簇也更富集肿瘤反应性TCR。同样，在接受抗PD-1治疗的BCC和SCC患者中，发现扩增最显著的克隆也存在于耗竭型CD8+ T细胞中，这表明强烈的肿瘤特异性扩增也可能导致T细胞耗竭。

在耗竭表型中克隆扩增的TCR富集带来了实验上的挑战，因为这些TIL可能过于耗竭，无法进行体外筛选，这为TCR筛选方法提供了理论依据，即通过在Jurkat或SKW-3等细胞系或新鲜原代PBMC中重新表达TCR来"挽救"其特异性，以进行功能测试。

在CD4+细胞中，Treg是一类具有免疫抑制作用的细胞亚群，其特征是持续表达FOXP3，并通过分泌包括IL-10和TGF-β在内的细胞因子以及参与抑制性受体作用等方式来抑制炎症反应。在小鼠模型中，通过给予抗CCR8单克隆抗体来清除Treg，可以重新激活肿瘤特异性的效应记忆T细胞，从而显著抑制肿瘤生长。因此，目前临床试验中正在探索多种清除Treg的策略，包括直接注射抗CD25抗体或输注去除了Treg的自体T细胞产品，但迄今为止效果有限。最近的研究表明，在所有CD4+ TIL中，Treg往往是克隆扩增最显著的细胞亚群。对于扩增最明显的克隆，Treg倾向于表达与传统CD4+ T细胞不同的TCR库，这表明肿瘤中占主导地位的Treg克隆并非来自外周高度扩增的传统T细胞（Tconv）克隆的转化。多篇研究报告指出，在包括肾细胞癌（RCC）、结直肠癌和乳腺癌在内的多种肿瘤类型中，Treg的浸润和克隆扩增均具有负面的预后价值。

另一方面，其他CD4+ T细胞亚群在有效免疫应答中也发挥关键作用，不仅通过辅助CD8+ T细胞，还表现出直接的细胞毒性。值得注意的是，用辐照过的SCC免疫小鼠可诱导出具有干细胞记忆样特征的新抗原tetramer阳性CD4+ T细胞，这些细胞可通过依赖CD40L的方式帮助内源性CD8+ T细胞，从而对活体肿瘤的攻击和再攻击提供持久保护。包含TH1型新生抗原特异性CD4+ T细胞的过继细胞治疗在多个病例报告以及一项I/II期临床试验中也被证实可诱导肿瘤消退。

总体而言，研究肿瘤中的TCR多样性、克隆组成和分布情况正成为了解有效抗肿瘤反应决定因素的重要工具，尽管迫切需要将这些信息与T细胞亚群的表型状态及其经实验验证的反应性知识相结合。

基于TCR的免疫疗法中TCR选择标准

通过对肿瘤内TCR库的分析所获得的见解，不仅有助于了解TME中的免疫动态，还为治疗转化提供了基础，使研究重点从合理的抗原选择方法转向TCR选择策略。这为明确TCR的识别、选择和优先排序标准奠定了基础，以便将其开发为TCR免疫疗法。

将TCR基因转移至自体外周血来源的T细胞相比直接使用TIL具有多项实际应用和治疗方面的优势。首先，PBMC可以通过微创操作更方便地获取，避免了手术切除肿瘤组织的需要。其次，TIL在TME中通常表现出显著的功能耗竭，而将TIL来源的TCR表达于更健康、未耗竭的外周T细胞中，可在保留抗原特异性的同时恢复其功能活性。最后，还可对经过基因工程改造的T细胞进一步进行遗传修饰，以提高其疗效、持久性或安全性，从而解决一个重要问题，即原本导致T细胞功能低下或耗竭的抑制性TME也可能在回输后损害表达这些TCR克隆型的工程T细胞的功能。有关进一步克服TME免疫抑制的T细胞工程策略的例子已在其他文献中被广泛综述。

MHC-I与MHC-II限制性TCR的比较

传统的癌症免疫治疗方法主要集中在分离受MHC-I限制的TCR，或尝试通过含有MHC-I限制性表位的癌症疫苗来激发CD8+介导的免疫应答，尽管目前已有数项研究开始探索靶向MHC-II新抗原受限的TCR选择策略。靶向CD4免疫的策略得到了多项研究的支持：在小鼠和人体中的证据表明，ICOS+ CD4+ T细胞是CTLA-4免疫检查点阻断治疗反应的重要相关因素；对接受CAR-T治疗患者的纵向追踪也显示，CD4+免疫应答（尤其是TH2型CD4+应答）对于T细胞功能持续性和白血病长期缓解具有重要意义。此外，最初设计用于包含MHC-I表位的RNA新抗原疫苗的临床试验表明，在黑色素瘤和肾透明细胞癌患者中，这些疫苗主要激发了由CD4+ T细胞介导的免疫反应。

新兴研究还正在探索通过工程改造非常规T细胞亚群用于癌症治疗的潜力。这包括开发MHC-I限制性CD4+ T细胞和MHC-II限制性CD8+ T细胞（图4）。经基因工程改造的CD4+ T细胞若表达MHC-I限制性TCR，可以直接靶向肿瘤细胞，而不依赖于MHC-II的表达--后者通常仅在APC上组成性表达，或在内皮细胞受到炎症刺激后才被诱导表达。此外，MHC-II限制性的CD8+ T细胞已被证明可对致癌病毒抗原产生多功能细胞因子反应。通过同时靶向两种MHC类型的肿瘤抗原，有望增强诱导持久应答和清除异质性肿瘤的效果。

图4 非传统MHC-I和MHC-II限制性T细胞工程示意图。（a）在原本表达CD4的CD4+辅助T细胞中，引入MHC-I限制性TCR以及CD8共受体。提供MHC-I限制性TCR使该T细胞能够识别组成性表达于有核细胞表面的p-MHC-I复合物，同时保留辅助或记忆功能。CD8共受体可稳定其与p-MHC-I复合物的相互作用。（b）在原本表达CD8的CD8+ T细胞中，引入MHC-II限制性TCR以及CD4共受体。提供MHC-II限制性TCR使该T细胞能够识别肽-MHC-II复合物，同时保留细胞毒性功能。图中还展示了TCR信号转导所需的CD3εδγζ亚基。

通过基序搜索和克隆扩增筛选TCRs

用于基于TCR的免疫治疗的TCR选择面临的一个关键挑战在于区分旁观者TCR和真正具有肿瘤反应性的TCR。在某一时间点浸润肿瘤的T细胞中，只有一部分实际上表达了针对肿瘤抗原的TCR，而其他T细胞识别的是与肿瘤无关的病毒、细菌或自身表位，这些TCR在用于TCR治疗时不仅无用，甚至可能有害。

第一步的负向筛选是通过在公共数据库中搜索CDR3序列匹配项，或利用已知TCR识别基序检测部分序列匹配，从而排除具有已知无关病毒或病原体反应性的TCR。不过，这种方法仍受到现有TCR数据库注释质量的限制。相反，在由病毒引发的癌症（如HBV或HPV相关癌症）中，鉴定针对病毒表位的TCR可以为靶向癌细胞提供一种高度特异性的方法。通过分析CDR3序列，TCRGP方法已在HBsAg+肝细胞癌患者中鉴定出针对HBV表位的TCR及其相关的转录状态。

进一步筛选潜在肿瘤反应性TCR的步骤是基于克隆扩增，以此作为肿瘤中抗原驱动增殖的替代指标，从而淘汰单例或低丰度的TCR克隆型，并集中关注高度扩增的克隆型。通常会对克隆扩增的空间分布进行分析，以筛选在肿瘤中优先扩增的克隆，尽管在肿瘤和外周共享的TCR中也可能发现肿瘤反应性克隆，这反映了癌症-免疫循环的生物学特性，即在引流淋巴结中激活的T细胞通过循环进入肿瘤。有证据表明共享克隆具有预后意义，例如在对靶向CD4的单克隆治疗有响应的患者中，其在血液和肿瘤中均可检测到共享的CD8+克隆扩增程度高于无响应者。

基于基因表达特征对TCR进行优先排序

除了简单的TCR丰度分析外，一些单细胞测序流程（例如10X Chromium和CITE-Seq）将TCR VDJ测序与全RNA转录组测序或使用寡核苷酸标记抗体的表面标志物分析相结合。此类流程关键性地实现了将TCR克隆型信息与表达这些TCR的T细胞的表型状态进行整合分析。肿瘤反应性TCR通常富集于抗原经历和耗竭亚群中，反映了先前对同源抗原的激活和增殖，尽管更精细的特征旨在进一步将肿瘤反应性与病毒或细菌诱导的激活区分开来。

多个研究团队通过将已确认具有肿瘤反应性的TCR逆转录映射到表达这些克隆型的T细胞的RNA测序数据中，从而获得了肿瘤或新生抗原反应性TCR的转录组特征（图5a）。例如，在多种转移性肿瘤类型中学习得到的NeoTCR特征显示，趋化因子CXCL13和CXCR6、效应基因如GZM-A/B/K和PRF1，以及抑制性标记物如TIGIT、PD1和LAG3的表达水平较高，同时包括IL7R和KLF2在内的干性标记物表达下调。

同样，PredicTCR分类器通过学习与实验确认的反应性相关的基因特征，识别出TIL中针对肿瘤的TCR。该实验通过将TCR与来源于转移性黑色素瘤的细胞系BT21进行筛选得出结果。随后，可解释AI识别出排名前10的转录本，其丰度可预测针对肿瘤的T细胞反应性，包括CXCL13、ANXA1、IL-7R和TPT1，尽管这种方法在不同类型癌症中的广泛适用性仍有待探索。随后，可利用肿瘤反应性特征前瞻性地对大量测序数据集中的TCR进行评分和优先排序，但重要的是，要推动TCR进入临床转化阶段，仍需对其肿瘤反应性进行实验验证。

根据表面标记激活表型对TCR进行优先排序

已经开发出几种功能性检测方法，用于实验验证TCR对癌症的反应性，包括将从肿瘤中纯化的TIL进行直接培养，或在T细胞系中重新表达TIL来源的TCR。这些检测方法采用自身肿瘤细胞系进行抗原无关的筛选，或者使用负载了特定癌症肽段的APC。这类以激活为导向的工作流程，可通过CD69或4-1BB等标记对T细胞进行分选，可用于识别或确认候选TCR的反应性（图5b,c）。

基于细胞表面标志物来识别肿瘤反应性的分子特征的一个优势在于，可以通过FACS富集具有活力的T细胞，而不像RNA测序那样需要裂解细胞。研究显示，在CD8+ TILs中，整合素CD103+和外核苷酸酶CD39+的特征与那些在肿瘤内相较于外周血中扩增最明显的克隆相关，这些克隆高表达耗竭标志物并呈现组织驻留记忆T细胞（TRM）表型，且富含能够杀伤自体黑色素瘤细胞的T细胞。尽管肿瘤反应性TIL富集的方法对于初始TCR发现具有帮助，但其在直接生产可用于细胞治疗的活性T细胞产品方面作用有限。

图5 肿瘤反应性TCR的鉴定方法。（a）基于RNA测序的鉴定方法。利用同时进行V(D)J和基因表达（GEX）分析的TIL或PBMC测序数据，可以通过已验证具有肿瘤反应性的T细胞基因表达特征进行评分。随后可选择被归类为具有推测肿瘤反应性表型的TCR用于进一步筛选。（b）流式细胞术鉴定方法。从患者体内分离的原代TIL或PBMC可通过FACS技术，利用如CD103、CD39或CD40L等潜在肿瘤反应性标志物进行染色标记，随后进行TCR测序或培养用于进一步实验。（c）将携带TCR文库的原代TIL、PBMC或Jurkat细胞系首先与自体肿瘤靶细胞或负载肿瘤抗原的细胞系共培养，随后通过CD69或4-1BB等活化标志物进行染色，再进行TCR测序或继续培养用于其他实验。所有示意图中，灰色TCR为旁观者TCR的示意图，绿色TCR为肿瘤反应性TCR的示意图。

T细胞工程

一旦发现一种或多种具有肿瘤反应性的先导TCR，就需要进行广泛的临床前筛选和优化，以开发出安全且有效的TCR-T细胞产品。如果目标肽段已知，则可以对TCR进行改造，以优化TCR与pMHC之间的亲和力。T细胞反应的强弱很大程度上取决于亲和力，即TCR与其pMHC配体之间相互作用的物理强度，这一数值通过结合常数KD（KD = koff/kon）表示，并可通过SPR技术进行实验测定。值得注意的是，整体T细胞反应不仅取决于亲和力，还取决于协同刺激强度（avidity），后者涵盖了多个TCR-pMHC相互作用的总强度，并进一步受到共受体结合的影响。

虽然抗体与其对应抗原的亲和力通常在nM（10^-9）级别，但TCR的亲和力通常要低得多，处于μ M（10^-6）级别。在癌症免疫治疗背景下，另一个额外的障碍是，由于胸腺中的阴性选择作用，针对自身肽段的TCR亲和力通常比针对非自身表位的TCR还要更低。为了克服内源性亲和力低的问题，单克隆抗体领域广泛采用的一种方法是利用噬菌体展示技术对CDR进行定向进化，该方法已成功将TCR的亲和力提高了高达10^6倍。然而，这类高亲和力TCR目前仅用于可溶性TCR形式，在T细胞中作为TCR使用时却无效。

过度的亲和力优化并不可取，因为包括使用针对源自HTLV-1的Tax肽的模型TCR在内的研究已经表明，在TCR亲和力谱的高端区域，T细胞的效应功能会下降，从而导致对低抗原密度靶标的应答能力丧失。由于T细胞激活需要200个TCR共同参与，与APC之间过强的相互作用会阻碍T细胞的连续激活，导致T细胞无法达到激活阈值（图6）。

图6 TCR亲和力的Goldilocks区域。示意图显示TCR对目标pMHC抗原的亲和力呈同心圆分布，高亲和力区域靠近中心TCR，而低亲和力区域则更远。Goldilocks区域这一名称来源于类比，表示TCR亲和力既不会"过高"也不会"过低"，而是刚好适合有效激活T细胞的区域。过高的亲和力会导致不良且有毒的交叉反应性，并使T细胞失去对低抗原密度靶点的响应能力；过低的亲和力则完全无法有效传递信号，或促使T细胞分化为记忆型而非效应型表型。狭窄的亲和力范围最有利于诱导强大的T细胞激活并维持肽段特异性。功能亲和力窗口并非TCR固有的特性，还取决于T细胞激活状态以及周围环境中的炎症信号等因素。

一个有趣的方法是利用Treg来发现具有高亲和力的TCR。Treg会优先从胸腺细胞中被选择出来，这些胸腺细胞在阳性选择过程中表现出与自身pMHC具有高亲和力的TCR相互作用。因此，可以从克隆扩增的肿瘤浸润性Treg中获取TCR，并将其转入患者自体的传统T细胞中，从而制造出对肿瘤相关自身抗原具有更高亲和力的治疗性T细胞产品。

负向筛选针对健康组织的交叉反应性

在对候选TCR进行临床前安全性评估时，一个关键的考虑因素是评估其交叉反应性，这主要是考虑到TCR与pMHC结合具有广泛性这一特点，更重要的是，此前曾出现过严重甚至致命的毒性案例，包括on-target, off-tumor的毒性以及off-target毒性。一些引人关注的案例包括：针对MART-1和gp100的高亲和力TCR导致了葡萄膜炎和听力损失，这是因为这些TCR识别了健康黑色素细胞（存在于皮肤、眼睛和耳朵中）上的表位。此外，2013年曾报告一例致死性心脏毒性事件，原因是针对MAGE-A3的HLA-A*01限制性TCR发生了脱靶交叉反应，攻击了来源于titin蛋白的肽段。这一事件成为重要的警示案例，并自此引发了对TCR安全性评估的高度重视。

尽管在实验上进行详尽的交叉反应性评估仍然极具挑战性，这一问题在计算上也尚未得到解决。对于具有已知特异性的TCR，替代性的实验方法包括测试TCR对包含对源肽每个残基位置进行替换的改变肽配体（APL）文库的识别能力，这些位置通常被丙氨酸取代，因为其体积小且侧链化学性质惰性，或者通过算法搜索反应性基序。也可以对细胞系或原代细胞进行功能性筛选，这构成了近期针对滑膜肉瘤的Tecelra（afamitresgene autoleucel）获得临床批准的基础，这也是首个获批用于实体瘤治疗的TCR-T细胞疗法。通过检测治疗性TCR对表达不匹配HLA的同种异体细胞系的交叉反应性，可以发现潜在的同种异体反应性，从而为临床禁忌症或排除标准提供依据，例如Tecelra针对的HLA-A*02:05等位基因型。

这里描述的以TCR为中心的方法中，治疗性TCR将从患者的TIL中鉴定出来，然后用于基因工程改造其自体T细胞。因此，所选TCR已经历了胸腺选择过程，从而对自身MHC以及来源于自身蛋白的肽段具有耐受性。结果表明，这些来源于TIL的自体TCR无需进行异反应性筛查。然而，所选TCR有可能识别肿瘤相关性自身抗原，而这些抗原也可能在患者胸腺以外的健康组织中表达。降低这种交叉反应风险的一种方法可能是从患者的健康组织中产生自体iPSC。将iPSC分化为代表多种正常组织的成熟细胞，可为测试TCR转导的T细胞提供一个平台，并筛选出那些识别非癌性自体细胞的TCR。

TCR的基因工程与治疗用细胞产品的制造

将TCR应用于过继细胞治疗产品中，需要采用基因组工程技术在T细胞中表达TCR。

与CAR领域的最新技术类似，目前用于受体永久表达的主要方法是体外逆转录病毒或慢病毒转导，这种方法能够实现持久表达，但存在基因组半随机整合的局限性，可能会导致插入性癌变，尽管迄今为止工程T细胞的安全性表现良好，但因放疗或化疗引起的继发性恶性肿瘤风险要高于病毒整合带来的风险。2017年，有研究人员提出了一种颇具吸引力的替代方法，即通过提供编码CAR的AAV模板，利用CRISPR-Cas9介导将CAR插入到内源性TRAC位点。这种方法不仅确保了在特定基因组位置的单一整合，还使得CAR的表达受到内源性调控模式的控制，从而避免了持续信号传导，并改善了体外细胞毒性和体内持久性。

在TCR-T疗法的背景下，通过敲除（KO）内源性TCR，并同时以转基因TCR结构取而代之，这一方法可减少对CD3表面表达的竞争，并降低错配的风险。目前，设计单一或双重TRAC/TRBC敲除的T细胞产品策略已在多项人体临床试验中得到广泛采用。然而，CRISPR/Cas9介导的敲除技术近期暴露出一个关键局限性，即脱靶效应可能引发双链断裂，从而带来基因毒性风险，导致大规模染色体易位和非整倍体现象。为实现持久表达，后续的基因工程策略进行了创新，例如通过同源重组修复（HDR）提供非病毒来源的TCR模板用于敲除操作，包括dsDNA和ssDNA模板，其中后者对T细胞毒性较低，或者依赖转座子系统。此外，也有研究采用瞬时基因重编程策略，通过电穿孔将编码TCR的mRNA导入T细胞，这种方法可降低基因毒性的风险，并能更精确地控制T细胞的剂量，尽管其在诱导T细胞保护作用的持久性方面可能存在一定局限。

总结

这里强调了以TCR为重点的策略在推动有效的抗肿瘤免疫反应方面的潜力，这种策略优先考虑对肿瘤内T细胞分布和克隆动态的理解，而非传统的以抗原为中心的方法。概述了识别肿瘤反应性TCR的方法以及进一步改进这些TCR以增强其治疗功能的策略。借鉴CAR-T领域的进展，其他T细胞工程技术，包括信号放大、细胞因子武装、抑制性受体敲除以及代谢重编程，都为进一步增强TCR-T细胞的适应性和功能提供了手段。随着强大的计算工具和检测方法的发展，使得TCR反应性的预测和验证成为可能，基于TCR的方法为开发更精准和持久的癌症免疫疗法提供了坚实的基础。

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