WB实际条带与预期不符？可算捋顺了

1、目的蛋白以其他形式存在，最常见的情况

● 翻译后修饰：

如糖基化，常见接受糖基化的氨基酸是丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)和羟赖氨酸(Hydroxylysine)，例如CD2，根据uniprot显示，其预测分子量应该在39kda左右，但是表观分子量一般在45kDa左右，这是由于CD2多个位点存在糖基化修饰，实际实验中，如果想探究分子量差异是否是由糖基化引起的，可以加入糖苷酶PNGase F切去糖基后，进行WB，而除了糖基化以外，还存在磷酸化，泛素化、甲基化、乙酰化等多种翻译后修饰。其中，糖基化、乙酰化、甲基化通常是使表观分子量变大，磷酸化通常不变或变大。

CD2理论分子量39kDa左右

表观分子量45kDa左右

Uniprot中显示CD2的糖基化

● 剪切：

如Caspase-7存在多种形式：

1）Procaspase-7：Caspase-7的前体形式，分子量约为37kDa；

2）Intermediate caspase-7：中间形式的Caspase-7，分子量约为28kDa；

3）Caspase-7 p20：活化的Caspase-7的片段之一，分子量约为20kDa。

Procaspase-7是Caspase-7的未活化前体形式，具有较大的分子量。当细胞受到凋亡信号刺激时，procaspase通过自身切割或被其他caspase（如initiator caspases）切割激活，形成较小的活性亚单位这些亚单位结合在一起形成有活性的异二聚体。这种情况可以设置诱导组和非诱导组进行验证。剪切后的表观分子量会变小。

Caspase-7兔单克隆抗体的WB结果

泳道1: HeLa全细胞裂解物20ug

泳道2: Jurkat全细胞裂解物20ug

泳道3: HEK-293全细胞裂解物20ug

二抗：山羊抗兔IgG,(H+L),1/10000稀释时缀合的HRP

预测分子量：34kDa

观察分子量：28,35kDa

暴露时间：180s

● 多聚体和共价结合聚体：

如果表观分子量和预测分子量呈现倍数增长，需要考虑是否是多聚体，添加还原剂如DTT可以验证是否为非共价结合聚体。

2、蛋白异常迁移

● 对于分子量小于20kDa的蛋白

传统的Tris-Glycine体系在用于SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）时，对于小分子量蛋白质的分离效果不佳，主要原因在于以下几个方面：

1）离子前峰的影响：在Tris-Glycine体系中，浓缩胶通常使用pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而电泳缓冲液和分离胶则使用pH8.3左右的Tris-Glycine缓冲液。当电泳开始时，甘氨酸(Glycine)在浓缩胶中的解离度较低，移动速度慢，形成一个移动的离子前峰。随着电场的作用，甘氨酸逐渐解离并加速移动，在这个过程中会产生大量的自由十二烷基硫酸根离子(DS-)，这些离子会与小分子量蛋白结合，导致它们聚集或变性，从而影响分辨率；

2）低分子量蛋白质的迁移问题：由于上述原因，小分子量蛋白质在通过浓缩胶进入分离胶的过程中可能会受到阻碍，导致条带模糊、拖尾或分辨率降低。特别是在分离小于20kDa的蛋白质或多肽时，这种现象尤为明显；

3）缓冲系统pH值的影响：Tris-Glycine系统的pH值较高，这可能导致小分子量蛋白质在电泳过程中的某些修饰或降解，进一步影响其分离效果。

因此推荐使用Tricine-SDS-PAGE体系对20kDa以下的小分子量蛋白质或多肽进行分离。Tricine作为电泳缓冲液成分之一，其pKa值较低(8.15)，使得它在电泳过程中不会像甘氨酸那样产生大量的游离DS-离子，从而减少了对小分子量蛋白质的影响，并且能够提供更高的分辨率。此外，Tricine-SDS-PAGE通常采用较低浓度的丙烯酰胺凝胶，以适应小分子量蛋白质的分离需求。

● 蛋白电荷或特殊结构如氨基酸侧链的特殊排列方式，电泳时存在迁移过快或过慢的现象。

3、蛋白marker的问题

和非预染marker相比，预染marker虽然使用更加方便，但是由于偶联了染料，也存在分子量偏移的现象，并且同一个marker在不同的电泳体系中，迁移速度也会有所偏差。

预染蛋白Marker(10-245kDa)

4、样本制备问题

● 膜蛋白95度加热变性会引起聚集，导致检测条带表观分子量增大；

● 样本变性或还原不彻底会影响抗原表位暴露，进而影响其迁移速率，样本制备时一定要保证上样缓冲液足量、在保质期内、并且要选对裂解液，看清具体成分；

● 样本一定要新鲜，有些蛋白极易发生降解，制备时要注意。

5、排除以上问题，最重要的就是要充分了解自己的样本是否表达目的蛋白，以及表达丰度如何，并且查询厂家的验证图，了解抗体的特异性如何。

WB终于有迹可循了！！！