一文读懂蛋白表达

蛋白表达是生命科学领域基础且关键的技术之一，尤其在重组蛋白生产中扮演着核心角色。科研人员在进行蛋白表达时，需从蛋白表达载体设计入手，结合适宜的蛋白表达系统，通过蛋白表达优化提升产量与活性，最终采用科学的蛋白纯化方法获得高质量蛋白。

一、重组蛋白生产中的关键步骤

在实验室中，重组蛋白生产主要包含以下几个环节：

1. 目标基因克隆与载体构建

选择合适的载体是高效蛋白表达的第一步。科研人员常用的表达载体一般包含强启动子（如T7、CMV）、多克隆位点和标签序列（如His标签、GST标签），方便蛋白的后期纯化。克隆时需确保插入的基因序列无突变，并进行密码子优化以适配表达宿主的翻译偏好，最大化表达水平。

2. 选择合适的蛋白表达系统

蛋白表达系统的选择极其关键。大肠杆菌系统适合表达简单、无复杂修饰的小分子蛋白，且速度快、成本低，但对复杂折叠和糖基化蛋白效果有限。酵母系统则提供一定程度的翻译后修饰，适合中等复杂度蛋白。昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统适合复杂蛋白和需要完整翻译后修饰的蛋白，虽然成本和时间较高，但产物质量更贴近天然状态。

3. 蛋白表达优化

科研中，蛋白表达量的提升是反复优化的过程。包括调整诱导剂（如IPTG）浓度、温度、表达时间和培养基成分。一般来说，降低培养温度（如从37℃降至16-25℃）能改善蛋白折叠，减少包涵体形成。对表达量不高的蛋白，可以尝试不同的启动子强度和标签位置（N端或C端），以优化翻译效率和蛋白稳定性。

4. 蛋白提取及溶解

蛋白表达后，如何高效提取和溶解蛋白也是挑战。大肠杆菌中表达的蛋白常见包涵体现象，需要使用尿素或硫脲等变性剂溶解后再进行复性。对于可溶性蛋白，温和的细胞破碎方法（如超声、酶解）配合缓冲液使用，能保持蛋白活性和稳定性。

二、蛋白表达系统深度解析

大肠杆菌表达系统

优势：成本低、培养速度快、操作简便，适合大量表达。劣势：无法进行复杂翻译后修饰，易形成包涵体。应用建议：适合结构域表达、酶活性蛋白、疫苗抗原的初步筛选。

酵母表达系统（如毕赤酵母）

优势：可进行简单糖基化，表达环境相对简单。劣势：糖基化模式与哺乳动物有所不同，可能影响蛋白活性。应用建议：适合中小分子蛋白、酶类和疫苗蛋白的表达。

昆虫细胞表达系统（Baculovirus）

优势：能表达复杂蛋白、进行较为完整的糖基化和其他翻译后修饰。劣势：成本高，表达周期较长。应用建议：适合结构复杂、需要功能性折叠的哺乳动物蛋白。

哺乳动物细胞表达系统（CHO、HEK293）

优势：翻译后修饰最接近人体蛋白，适合生产临床用生物制品。劣势：培养周期长，成本高，操作复杂。应用建议：抗体、融合蛋白、生物药物研发与生产的首选。

三、蛋白表达载体设计与表达优化

蛋白表达载体是表达调控的核心模块。载体设计需结合目标蛋白的结构特性，合理选择融合标签的类型及其在蛋白上的位置。N端或C端标签不同，可能影响蛋白的折叠和活性。标签的可切除设计同样关键，方便后续获得天然蛋白。

蛋白表达优化涵盖多个层面：

诱导剂浓度与时间：降低IPTG浓度、延长诱导时间能减轻细胞压力，减少包涵体形成，增加可溶性蛋白产量。

培养温度调控：低温表达（16℃-25℃）有助于蛋白正确折叠，提升活性。

培养基配方和共表达伴侣蛋白：优化营养成分，辅助蛋白折叠，提高产量和质量。

现代实验常采用多因素设计（DOE）策略，系统筛选不同参数组合，快速找到最佳表达条件，显著提升重组蛋白生产效率。

四、蛋白纯化方法及应用

蛋白纯化是获取功能性蛋白的必经步骤。融合标签为纯化提供了便捷手段，亲和层析（如镍柱纯化His标签蛋白）因高效且简便而广受欢迎。GST和MBP标签则因其提升溶解性的能力，适合难表达蛋白的纯化。

离子交换层析根据蛋白电荷差异进行分离，可有效去除杂质，提高纯度。凝胶过滤层析则按分子大小进行分离，常用于缓冲液交换和去除聚集体，保证蛋白的结构完整性。

纯化过程中需注意蛋白降解和回收率问题，通常通过添加蛋白酶抑制剂、低温操作和缩短纯化时间来缓解。合理设计标签切除步骤，有助于获得无标签的天然蛋白。