重组蛋白表达系统|原核大肠杆菌|酵母|昆虫杆状病毒|哺乳动物

重组蛋白（Recombinant Protein）是通过基因工程技术，将目标基因从生物体中提取出来，并克隆到合适的载体中，然后将其转化到宿主细胞内。宿主细胞会利用其内在的转录和翻译机制，按照插入的基因序列合成目标蛋白。与天然蛋白相比，重组蛋白通常具有特定的功能和纯度，因此广泛应用于科研、药物开发、疫苗生产以及工业领域。

常见的重组蛋白表达系统及优缺点

1、原核大肠杆菌蛋白表达系统：大肠杆菌（如E. coli）是最常用的重组蛋白表达系统。它通过将目标基因插入大肠杆菌的质粒中，借助其快速的生长能力进行蛋白生产。大肠杆菌能够快速复制并在短时间内增殖，从而实现高效的蛋白表达。

2、酵母蛋白表达系统：酵母（如Saccharomyces cerevisiae）是一种真核微生物，能够进行一定程度的转录后修饰。酵母表达系统一般通过转化质粒，将目标基因导入酵母细胞，在酵母的内质网和高尔基体中完成蛋白的修饰与折叠。

3、哺乳动物细胞蛋白表达系统：哺乳动物细胞（如CHO、HEK293等）是最复杂的真核细胞表达系统，能够进行完整的转录后修饰。通过基因转染将目标基因导入哺乳动物细胞，细胞在体外培养时生产蛋白。

4、昆虫杆状病毒蛋白表达系统：昆虫细胞（如Sf9、Sf21等）用于重组蛋白表达时，通常通过杆状病毒（Baculovirus）感染昆虫细胞进行表达。昆虫细胞系统能够通过病毒载体将目标基因导入细胞，生产目标蛋白。

5、无细胞蛋白表达系统：无细胞系统（如reticulocyte lysate系统、E. coli无细胞系统等）通过提取细胞裂解液，将转录和翻译机制重建在体外。通过向系统中添加所需的分子和原料，可以快速合成目标蛋白。

重组蛋白表达系统优缺点：

重组蛋白表达生产步骤

重组蛋白的生产步骤通常包括以下几个关键环节：首先，目标基因通过PCR等方法克隆到合适的表达载体中；然后，将载体转化到选定的宿主细胞（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞）中进行表达；接着，在适当的培养条件下诱导蛋白表达，并通过破碎细胞或分泌系统提取目标蛋白；最后，使用各种纯化技术（如亲和层析、离子交换层析等）进行蛋白纯化，确保获得高纯度的重组蛋白。

载体构建、基因克隆、转化及表达系统的选择

1、载体构建

载体是将目标基因转化为宿主细胞的工具。选择载体时需要考虑其大小、复制方式、选择标记和表达调控元素等。常用的载体包括质粒载体、病毒载体等。

在构建过程中，往往需要加入标签序列（如His标签、GST标签等），便于后续的蛋白纯化与检测。

2、基因克隆

基因克隆是将目标基因插入到载体中的过程。常用的克隆技术包括限制性内切酶切割法、连接酶连接法、Gibson组装法等。克隆过程中，通常还会对基因进行一定的修饰（如改变密码子优化、添加标签序列、引入突变等）以适应宿主表达需求。

3、转化

转化是将重组载体导入宿主细胞的过程。不同的宿主细胞有不同的转化方法。对于大肠杆菌，可通过热击法或电转化将质粒DNA导入；对于真核细胞，常用的方法有脂质体转染、电转化、病毒感染等。

选择合适的转化方法和表达系统至关重要，不同的宿主细胞会对蛋白的折叠和修饰产生不同影响。

常用的蛋白表达载体

1、大肠杆菌蛋白表达系统：

pET系列载体是当前大肠杆菌重组蛋白表达的首选载体，具有最低的基础表达水平，通过调节诱导剂（如IPTG）浓度来控制目标蛋白的表达。该系统通过有效的RNA聚合酶机制，确保在充分诱导下，几乎所有细胞资源都用于蛋白表达。

2、酵母表达蛋白系统：

在酵母胞内表达中，常用载体包括pPIC3K和pPIC3.5K，而分泌型表达常用pPIC9K载体。筛选标记通常采用His4，用于标记和选择阳性克隆。

3、昆虫表达蛋白系统：

常见的昆虫表达载体有pFastBac1、pFastBacHT和pFastBacDual，常用的表达细胞是Sf9细胞。

4、哺乳动物表达蛋白系统：

常用的哺乳动物表达载体包括pcDNA3.1、pCEP4和pATX1等。常见的表达细胞为HEK293和CHO-K1细胞，适用于高效的蛋白表达和生产。

5、无细胞表达系统：

无细胞表达系统常用载体如pT7CFE1、TNT、pET-21a和pCITE系列，能够高效地在体外进行蛋白表达，广泛应用于功能研究和高通量筛选。