从单细胞测序数据筛选肿瘤特异性TCR、表位和HLA的整合系统

TCR-T细胞免疫疗法已成为癌症治疗的一种有前景的策略。然而，由于肿瘤异质性、肿瘤特异性T细胞的稀缺以及HLA的多样性，识别可用于生成TCR-T细胞的TCR仍然具有挑战性。为了推动TCR-T免疫疗法的发展，迫切需要开发一种高效且可扩展的方法来识别肿瘤特异性的TCR。为了鉴定肿瘤特异性的TCR、表位及其对应的HLA亚型，这里，北京协和医学院开发了一种方法，能够快速组装通过单细胞分析从不同肿瘤中鉴定出的TCR。对于每一个TCR，仅需合成对应TCR α和β链CDR3区域的两对寡核苷酸，即可实现以经济高效的方式快速构建TCR文库。还改造了HLA敲除的HEK-293T细胞作为抗原呈递细胞，使其表达患者特异性的HLA-I类分子和新抗原，并构建了Jurkat NFAT-GFP报告细胞系用于筛选抗原反应性TCR。通过从宫颈癌患者中筛选HPV16特异性TCR的小规模实验验证了该TCR筛选系统的有效性。成功开发了一种TCR组装方法，可在两天内实现TCR文库的快速克隆与构建，显著加快了流程并降低了成本。抗原呈递系统还允许灵活表达患者特异性的HLA-I分子，有助于个性化筛选。Jurkat报告细胞表现出高灵敏度，可用于筛选功能性TCR。利用来自HPV16阳性宫颈癌患者的公开数据集，成功应用该系统分离出一种针对HPV的TCR。通过缺失分析、丙氨酸扫描和质谱分析，确定该TCR可特异性识别由HLA-B*15:18呈递的来源于HPV-E7的8mer肽段（MHGDTPTL）。此外，表达该TCR的T细胞能够有效杀伤HPV阳性细胞。这里开发了一种整合的抗原呈递、TCR组装及TCR报告系统，用于利用单细胞测序数据筛选肿瘤特异性TCR。通过使用该系统，成功鉴定出一种具有功能性的HPV特异性TCR，展示了该方法在高效筛选肿瘤特异性TCR以推动TCR-T免疫治疗方面的潜力。

在肿瘤中，T细胞表现出多种多样的抗原特异性。其中一些T细胞能够识别由MHC分子呈递的肿瘤特异性抗原肽，但也有相当一部分属于旁观者T细胞，它们因非肿瘤抗原（例如病毒或自身抗原）而被激活。肿瘤特异性T细胞通常在引流淋巴结或肿瘤内部被激活。然而，这种激活发生在一个非炎症性和非刺激性的环境中，导致这些T细胞进入无反应状态。随着肿瘤的发展，这些T细胞会最终变得极度耗竭并失去功能。这些功能失调的T细胞可以通过其转录组特征进行识别，并可通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术获取其TCR序列。这里，开发了一种抗原呈递、TCR组装和TCR报告系统，利用肿瘤样本的单细胞测序数据来筛选肿瘤特异性TCR。通过从宫颈癌样本中鉴定出一种针对HPV16的TCR验证了该筛选系统，该TCR可识别由HLA-B*15:18呈递的E7蛋白来源的肽段表位。该系统有望在未来以经济高效且节省时间的方式，同时筛选来自肿瘤的数百种TCR，从而识别肿瘤特异性TCR、肽段表位以及相应的HLA亚型，为TCR-T免疫治疗提供支持。

建立高效的肿瘤新抗原特异性TCR筛选系统

为了建立一个用于鉴定肿瘤特异性TCR的实验系统，首先对人类白血病Jurkat T细胞进行了改造，以生成一个NFAT-GFP报告细胞系（JTR）（图2A）。Jurkat细胞系被广泛用于研究TCR介导的信号传导，它天然表达CD4和一种抗原特异性TCR。在这些细胞中，TCR的激活会触发TCR信号级联反应，其中钙离子通路是最终激活NFAT的主要信号通路。为了使系统能够鉴定识别由MHC-I分子呈递的抗原肽的CD8+ T细胞中的TCR，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术依次敲除了内源性TCR和CD4基因，从而获得了CD4-/TCR- Jurkat细胞。随后，构建了一个包含人CD8α和NFAT-GFP报告基因的逆转录病毒载体，其中GFP的表达由含有三个NFAT结合位点的IL-2最小启动子控制。此外，还构建了另一个表达CD8β的逆转录病毒载体（图S1A）。在同时转导这两种逆转录病毒后，通过FACS分选获得了CD8α+/CD8β+细胞并进行了亚克隆。随后，使用PMA和Ionomycin诱导GFP表达来检测各个亚克隆的反应，这两种物质可以绕过TCR上游的信号传导。如图2B所示，在PMA和Ionomycin刺激4h后，一个代表性亚克隆中超过90%的细胞表达了GFP。

T细胞的活化发生在TCR与APC细胞或靶细胞上的MHC-肽复合物结合之后。在人体中，MHC-I类分子的重链具有高度多态性，由三个基因编码：HLA-A、HLA-B和HLA-C。细胞表面最多可表达6种不同的HLA-I蛋白，它们向CD8+ T细胞呈递多种表位，实现广泛的免疫监视。为了确定每个TCR识别的HLA-I亚型及其结合的肽表位，构建一种仅表达一种HLA等位基因的细胞系。还利用CRISPR基因编辑技术，在HEK-293T细胞中靶向编码HLA-A、HLA-B和HLA-C保守α3结构域的外显子。随后，通过FACS进一步分选获得HLA-/-细胞群体（图2A和图S1B）。

为了验证该报告细胞系是否确实可用于筛选抗原特异性TCR，将HLA-A*02:01引入HLA-/- 293T细胞，并用针对HLA-A*02:01限制性MART-1表位（EAAGIGILTV）的低亲和力TCR（DMF4）和高亲和力TCR（DMF5）重建了JTR细胞（图S1B、C）。表达DMF4或DMF5 MART1-TCR的JTR细胞与经MART-1肽段处理过的HLA-A*02:01+ 293T细胞共培养。如图2C所示，在存在MART-1肽段的条件下，超过67%的表达DMF4或DMF5 TCRMART1的JTR细胞呈现GFP阳性。相比之下，当HLA-A*02:01+ 293T细胞经TP53 R175H肽段（HMTEVVRHC）处理后，未检测到明显的GFP表达。这些结果表明，JTR报告细胞能够很好地响应高亲和力和低亲和力TCR的抗原识别。

为了评估TCR筛选平台的灵敏度，将TCR- JTR细胞与JTR-TCRDMF4或JTR-TCRDMF5以不同比例混合，以模拟在TCR筛选过程中表达TCR亚库的T细胞中个别T细胞克隆的低频率情况。如图2D所示，即使TCR-细胞与TCR+细胞的比例低至1:100时，仍可检测到GFP+细胞，无论所测试的TCR是低亲和力的DMF4还是高亲和力的DMF5 TCR。当使用表达MART-1 26-35 mini基因的HLA-A*02:01+ 293T细胞作为APC时，也观察到了类似的结果（图S1D），进一步证明了该TCR筛选平台的高灵敏度。

免疫蛋白酶体是蛋白酶体的特殊形式，主要生成能够与MHC结合的抗原肽。研究表明，用TNF-α或IFN-γ刺激非免疫细胞可诱导免疫蛋白酶体亚基（如LMP2和LMP7）的表达。与组成型蛋白酶体不同，免疫蛋白酶体具有不同的切割偏好性，生成适合与MHC I类分子结合的肽段，从而增强向细胞毒性T淋巴细胞呈递抗原的能力。为了检测是否能够增强293T细胞向T细胞呈递抗原的能力，用TNF-α、IFN-γ或两者共同处理293T细胞。首先，进行了实时PCR分析LMP2和LMP7的表达，发现TNF-α和IFN-γ均可显著诱导HEK-293T细胞中这两个亚基的表达（图S1E）。随后，进一步用TNF-α和IFN-γ单独或联合处理表达MART-1 26-35 mini基因的HLA-A*02:01+ 293T细胞，并用这些细胞刺激JTR-TCRMART1细胞。如图2E和图S1F所示，JTR-TCRDMF4和JTR-TCRDMF5细胞中GFP阳性细胞的比例以及GFP的平均荧光强度均显著增加，表明TNF-α和IFN-γ处理可能通过诱导LMP2和LMP7的表达增强了293T细胞向T细胞呈递抗原肽的能力。

图2 建立一个用于筛选肿瘤特异性TCR的平台。

图S1 Jurkat TCR 报告细胞（JTR）的制备

开发一种用于克隆大量TCR的新方法

与BCRs/抗体类似，TCRs也是通过RAG介导的V、D和J基因片段重组而形成的。在人类中，TCR-α基因包括大约70个Vα、61个Jα和1个Cα片段，而TCR-β基因则由52个Vβ、2个Dβ、13个Jβ和2个Cβ片段组成。然而，与BCR不同的是，TCR没有体细胞高频突变和亲和力成熟过程。因此，重组后的TCR序列在T细胞应答过程中保持不变。基于这一特性，开发了一种全新的TCR克隆方法，能够同时构建大量TCR。与通过基因合成逐一克隆TCR相比，这种方法具有高效且快速的优势。

首先在pUC57质粒中合成了多种人Vα、Jα、Cα、Vβ、Jβ和Cβ基因片段。mCherry基因两侧带有两个Bbs I限制性酶切位点，被克隆入每个质粒中作为填充物，以避免在后续PCR步骤中被原始质粒扩增的片段污染（图1A）。经Bbs I消化后，黏性末端的核苷酸在Vα或Vβ的3'端编码一个Cys残基，在部分Jα或Jβ片段的5'端编码一个Phe残基（其余Jα或Jβ位于CDR3区域中），但Jα33、Jα35和Jα38除外。Jα33和Jα38片段在此位置上为Trp而非Phe，而Jα35则在此位置上为Cys。值得注意的是，在用Bbs I消化后，设计的序列在每个位点产生不同的黏性末端，从而防止在随后与α链和β链的CDR3片段连接过程中可能出现的错配。TCR-α链和β链通过一段自剪切T2A序列连接。

经过Bbs I消化和凝胶回收后，获得了单独的Vα、Jα-Cα-T2A、T2A-Vβ和Jβ-Cβ DNA片段。对于每个TCR，分别设计编码CDR3α和CDR3β序列的正向和反向引物进行退火，然后根据TCR克隆型将它们与其对应的Vα、Jα-Cα-T2A、T2A-Vβ和Jβ-Cβ片段连接。将连接产物作为模板进行PCR扩增，最终获得包含α链和β链的完整片段（图1B）。由于来源于肿瘤的大多数TCR并不特异识别我们感兴趣的新生抗原，因此把多个TCR片段混合在一起，经凝胶纯化后通过Gibson连接克隆至逆转录病毒载体中，构建出一个小型的TCR子文库。由于报告系统能够在100个T细胞中轻松识别出一个阳性克隆（图2D），将不同的TCR克隆型组合在一起，可在时间和成本方面提高筛选功能性TCR的效率（图1C）。一旦发现阳性子文库，便可从中取出各个TCR片段进行连接，获得特定的TCR克隆用于进一步筛选。通过此方法，可在2天内完成多个TCR的快速克隆和文库构建。此外，对于每个TCR，仅需合成两对分别针对其特异CDR3α和CDR3β区域的引物。该方法显著降低了实验成本，并可在数天内构建包含数百个TCR的文库。

图1 全长α和β链的肿瘤来源TCR的组装。

HPV16 E6/E7特异性TCR的筛选

为了检测抗原呈递、TCR组装和报告系统是否能够成功用于筛选肿瘤特异性T细胞，选择鉴定HPV特异性TCR，这些TCR未来也有望用于TCR-T免疫治疗。HPV在宫颈癌的发生中起着关键作用，主要是通过表达两种重要的致癌蛋白E6和E7。为了筛选E6/E7特异性TCR，分析了来自HPV16阳性鳞状宫颈癌样本的10×scRNA-seq数据。在完成质量控制后，总共聚类了4,157个细胞，识别出19个不同的细胞亚群（图3A）。基于Single R分析，这些亚群进一步被归类为七种细胞类型（图3B）。随后，根据基因表达panel对总共2,222个T细胞进行了重新聚类。将cluster "0"和"5"定义为肿瘤反应性CD8+ T细胞，因为它们持续与肿瘤抗原相互作用，并表达耗竭相关标志物，包括ENTPD1、ITGAE、PDCD1、TIGIT、LAG3、HAVCR2和CTLA4，以及免疫细胞归巢标志物CXCL13（图3C）。Cluster "1"表现出GZMK、NKG7和IFNG的高表达，可能代表效应CD8+ T细胞。在这些CD8+ T细胞聚类中，分析了TCR克隆型频率的分布。如图S2所示，高频T细胞克隆的数量呈指数下降，表明有限数量的TCR克隆型发生了显著的克隆扩增，这可能是由肿瘤抗原特异性免疫反应驱动的。基于这一观察结果，采用了相对保守的阈值（n>10），总共鉴定出19对高频TCR作为潜在的肿瘤反应性TCR，并提取了它们的TCR信息。图3D展示了这19种TCR克隆型的TCR-α和β链CDR3序列及其在不同T细胞亚群中的相对分布。一些克隆在cluster "0"中占主导地位，而另一些则在cluster "1"中更为丰富。通过上述方法，还在来自10×scRNA-seq数据集的另外两个HPV16阳性鳞状宫颈癌样本中鉴定了高频TCR。

图3 通过单细胞RNA分析筛选潜在的肿瘤反应性TCR。

图S2 各样本中TCR克隆型频率的分布情况。

接下来，利用该系统筛选出对HPV E6/E7抗原具有反应性的TCR（图4A）。为了构建一种能够通过患者来源的HLA-I呈递抗原肽的APC细胞系，构建了一种含有通过GGGGS连接子连接的HPV16 E6和E7基因的逆转录病毒质粒（图S3A），以及一种在C末端带有Myc-His标签的HLA I类分子表达质粒，以便通过质谱鉴定p-MHC复合物中的肽。通过逆转录病毒感染，将E6/E7和HLA-I基因导入HLA-/- 293T细胞，并用抗Myc抗体进行Western blotting和用抗HLA-A/B/C抗体进行流式细胞术检测，确认了它们的表达（图4B和图S3B）。总共73种潜在的TCR对被分为10个亚文库，每个亚文库包含5-10对TCR。如图2B,C所示，将TCR亚文库构建后通过逆转录病毒感染导入JTR细胞。选择将每个亚文库中的TCR对数量限制在少于10对。如图2所示，当表达特定TCR的T细胞超过总T细胞数的10%时，GFP表达明显。此外，包含少于10种TCR克隆类型的亚文库也有利于后续对单个TCR的识别。流式细胞术分析表明，超过50%的JTR细胞表达了TCR（图S3C）。为了筛选出能与E6或E7来源的抗原肽复合的HLA-I相互作用的TCR，将感染后的JTR细胞分别与稳定表达HPV16 E6/E7和某一特定患者HLA-I的HLA-/- 293T细胞共培养24h。如图4C所示，当表达亚文库2的JTR细胞与表达HLA-B*15:18和E6/E7的HLA-/- 293T细胞共培养时，检测到约2%的JTR细胞中GFP高水平表达。而当这些细胞与表达其他HLA-I亚型的HLA-/- 293T细胞共培养时，仅检测到背景水平的GFP。接下来，将该亚文库中的各个TCR分别进行亚克隆并在JTR细胞中表达，然后与稳定表达HPV16 E6/E7的HLA-B*15:18+ 293T细胞系共培养。只有表达TCR2-3的细胞表现出GFP表达，表明该TCR对由HLA-B*15:18呈递的E6或E7来源的肽具有反应性（图4D和图S3D）。此外，当使用感染了表达HLA-B*15:18逆转录病毒的SiHa细胞系（HPV16阳性的宫颈癌细胞）刺激JTR细胞时，也观察到了GFP表达。

为了检测TCR2-3在人CD8 T细胞中的表达是否能够使它们杀死靶细胞，通过将人TCR-α和β链的恒定区替换为小鼠的相应区域，构建了一种嵌合TCR，并通过逆转录病毒转导的方式将其表达于健康供体来源的CD8 T细胞中（图4E）。在细胞毒性实验中，使用了表达HLA-B*15:18的SiHa细胞作为靶细胞。如图4F所示，HPV特异性的TCR-T细胞对HLA-B*15:18+ SiHa细胞表现出强烈的杀伤能力。在针对同时表达HLA-B*15:18和HPV16抗原的K562细胞的实验中，也观察到类似的细胞毒性反应（图S3E）。综上所述，数据证明了利用该TCR筛选策略识别功能性肿瘤特异性TCR的可行性。

图4 利用TCR筛选平台筛选HPV特异性TCR。

图S3 利用宫颈癌患者单细胞数据集筛选HPV特异性TCR

HLA限制性表位分析

为了确定TCR2-3识别的表位，使用netMHCcons 1.1预测E6和E7蛋白中哪些表位可由HLA-B*15:18呈递。如图5A所示，有8个肽段被预测可强烈结合HLA-B*15:18，其中1个来自E7，7个来自E6。将JTR-TCR2-3细胞与负载了E7 1-11（MHGDTPTLHEY）肽段的HLA-B*15:18+ 293T细胞共培养，可诱导强烈的GFP表达。相比之下，与未负载肽段的293T细胞或负载了其他7个E6来源肽段的293T细胞共培养时，则未检测到GFP表达（图5B），表明该TCR能够与由HLA-B*15:18呈递的该E7肽段相互作用。

为了进一步验证HPV16-E7 1-11肽是否确实是HLA-B*15:18呈递的表位，合成了从N端或C端截短的肽段，长度范围为8-10个氨基酸。如图5C所示，将JTR-TCR2-3细胞与负载了从N端截短1、2或3个氨基酸的肽段的HLA-B*15:18+ 293T细胞共培养后，未观察到TCR识别，表明Met确实是该肽段中与HLA-B*15:18结合的第一个氨基酸。从C端截短1个氨基酸的肽段（MHGDTPTLHE）诱导的GFP阳性细胞比例略高于使用HPV16-E7 1-11肽段刺激的结果；然而，截短两个氨基酸（MHGDTPTLH）则削弱了其激活JTR-TCR2-3细胞的能力。令人意外的是，E7 1-8（MHGDTPTL）肽段诱导了更高比例的GFP阳性细胞，提示该TCR识别的是HPV16-E7 1-8表位。估算该肽段激活JTR-TCR2-3细胞的半数有效浓度为29.87 nM（图5D）。

为了进一步确认该8个氨基酸残基的表位确实是被该TCR所识别的表位，进行了丙氨酸扫描实验，分别构建了HPV16-E7 1-11区域中每个残基发生突变的E7蛋白表达载体。这些突变的E7基因通过逆转录病毒转导的方式引入HLA-B*15:18阳性293T细胞中，从而使得E7抗原在细胞内被内源性加工处理。如图5E所示，当P1-Met、P9-His、P10-Glu和P11-Tyr发生突变时，GFP表达水平没有明显变化。这一结果在预期之中，因为根据截断实验的结果，P9-His、P10-Glu和P11-Tyr很可能并不属于实际的表位。根据既往对MHC-肽相互作用的结构研究，P1-Met的侧链通常朝向抗原结合沟槽的上方。将该位点替换为丙氨酸未产生影响，表明P1-Met并不参与TCR识别，但可能对肽段与MHC分子的结合是必需的。然而，其他位置的突变则显著降低了GFP表达水平，尤其在P2-His、P4-Asp、P6-Pro、P7-Thr和P8-Leu这几个位置。使用TCRmodel2程序模拟了TCR与p-MHC复合物之间的相互作用。P2-His和P8-Leu嵌入在HLA-B*15:18的沟槽中（图5F，G），属于肽段结合所需的锚定残基；P4-Asp与CDR3α相互作用，而P7-Thr则与CDR3β接触，提示它们直接参与了与TCR的结合。至于P6-Pro，它可能在维持结合肽段构象的稳定性方面发挥重要作用。

图5 HLA-B*15:18呈递的HPV表位分析。

为了明确证明MHGDTPTL是结合HLA-B*15:18的肽表位，用镍珠从稳定表达HLA-B*15:18以及E6/E7的HLA-/- 293T细胞中纯化了HLA-B*15:18分子，洗脱结合的肽段，并通过串联质谱（MS/MS）分析其肽段组成。总共鉴定出6,302条肽段，长度主要分布在8-11个氨基酸之间，其中以9个氨基酸的肽段最多（图6A）。通过质谱分析，鉴定出两条来自HPV16-E7的肽段（MHGDTPTL和DLQPETTDL）以及一条来自HPV16-E6的肽段（SKISEYRHY）（图6B-D），这进一步验证了此前的截短和突变实验结果。值得注意的是，这三个肽段均未被netMHCcons 1.1预测为可结合HLA-B*15:18的肽段，而netMHCcons 1.1是一个整合了当前最先进的三种预测工具NetMHC、NetMHCpan和PickPocket的程序，被认为具有最高的预测准确性。这表明目前的表位预测程序仍存在一定局限性。有趣的是，质谱鉴定出的肽段中，第二位最常见的是组氨酸（H），而在C端作为锚定残基则更倾向于疏水性残基Y、F和L，说明HLA-B*15:18倾向于结合第二位为H、C端为疏水性残基的肽段，这些位置的残基起到了锚定作用（图6E）。综上所述，该研究结果证实了通过对宫颈癌患者scRNA-seq数据分析所鉴定出的TCR能够识别由HLA-B*15:18呈递的来自HPV16-E7蛋白的8肽（MHGDTPTL）。该TCR有望用于制备TCR-T细胞，以治疗宫颈癌患者。

图6 HLA-B*15:18等位基因洗脱肽段的质谱分析。

总结

开发快速、高效且经济的方法来筛选大规模的TCR库，并找出那些能够靶向并杀死肿瘤细胞的TCR，对于TCR-T免疫疗法至关重要。在这里，成功建立了一个包含抗原呈递系统、TCR组装流程以及TCR NFAT-GFP报告细胞的实验体系，用于筛选肿瘤特异性TCR。利用已发表的宫颈癌患者的scRNA-seq数据集，通过该平台构建了小型TCR文库，并成功鉴定出一种具有功能性的、针对HPV16的TCR。方法适用于筛选其他癌症类型的新抗原特异性TCR，特别是那些源自频繁突变的肿瘤驱动基因（如TP53和KRAS）所产生的新抗原。鉴定能够识别由HLA-I呈递的新生抗原衍生肽的TCR，对于推进TCR-T免疫疗法治疗癌症患者具有重要意义。

为了更高效地从具有不同HLA单倍型的癌症患者中筛选出针对新抗原的T细胞，构建了一种细胞系，其所有三种HLA-I类基因（HLA-A、HLA-B和HLA-C）均已被突变失活。选择HEK-293T细胞作为APC，因为它们能够高效地同时转染多个质粒。例如，常规地共转染一个表达特定HLA-I等位基因的质粒和一个包含新表位肽的串联mini基因质粒。此外，用TNF-α和IFN-γ刺激293T细胞可上调免疫蛋白酶体的表达，从而增强抗原肽的生成，并改善其抗原呈递能力。由于这种细胞系可以方便地重建患者特异性的HLA-I等位基因，并可用于激活经过TCR重建的T细胞，因此该方法避免了使用活体癌细胞来刺激T细胞以鉴定由HLA I类分子呈递的新表位的需要。这里仅在HLA-/-细胞中重建了一个HLA I类等位基因，但实际上也可以同时重建两个或更多等位基因，以减少激活报告细胞所需的APC种类数量。

在肿瘤中，各种类型的T细胞表现出不同的抗原特异性。其中一些只是旁观者T细胞，而另一些则表达TCR，能够识别由自身MHC分子呈递的新抗原或肿瘤相关抗原衍生的肽段。肿瘤反应性T细胞在肿瘤微环境中会有所扩增，但常常因为免疫抑制的环境而失去功能。肿瘤细胞通常具有异质性，携带大量突变，包括肿瘤驱动基因中的突变。由于这些驱动基因在肿瘤发生中起关键作用，而且它们的突变在肿瘤细胞中普遍存在，因此靶向来自肿瘤驱动基因的新表位成为TCR-T免疫治疗的一个有前景的策略。因此，识别能够识别肿瘤驱动基因衍生新表位的TCR及其呈递这些表位的HLA亚型至关重要。传统识别这些TCR的方法包括：（1）使用合成肽在体外扩增TILs；（2）利用tetramer从新鲜或扩增后的TILs中分选新抗原特异性T细胞，然后对TCR-α和β链进行测序并进行功能性鉴定。然而，体外扩增TILs耗时较长，并且需要新鲜或保存良好的肿瘤样本。此外，肽段刺激通常使用比HLA自然呈递的肽段更长的肽段，可能降低其效果。基于tetramer的分选方法需要事先了解HLA亚型及其呈递的特定肽表位，这可能是一个限制因素。随着scRNA-seq技术的发展，现在可以直接从新鲜或保存良好的肿瘤样本中获取TCR序列，而无需进行体外扩增。此外，许多已发表的来自各种肿瘤的scRNA-seq数据集尚未被充分利用来识别肿瘤特异性TCR。为了利用这些数据集以及未来将使用新肿瘤样本生成的数据集，开发了一种系统，用于重建表达肿瘤特异性TCR的T细胞库，以便进一步筛选其抗原特异性。基于肿瘤反应性T细胞的基因表达谱，可以通过排除旁观者T细胞，有效缩小潜在TCR的范围，从而提高筛选效率。使用这种方法，成功克隆了大量TCR并筛选了它们的抗原特异性。对于每个TCR克隆，只需两对寡核苷酸即可生成表达TCR-α和β链的逆转录病毒构建体。报告细胞系能够识别对特定HLA和肿瘤表位具有反应性的TCR。尽管这里主要聚焦于筛选相对较少数量的TCR，但该方法具有可扩展性，通过将潜在TCR分成包含5-10种不同TCR的小型子库进行初步筛选，从而减少转染、细胞培养和数据分析所需的工作量和成本，能够在1-2周内实现数百个TCR的克隆与筛选。与全长TCR合成相比，更具成本效益且节省时间。目前，正在应用这一策略筛选来自各种癌症的TCR，这些TCR能够识别关键肿瘤驱动基因（如RAS和TP53）中的突变。

利用该抗原呈递、TCR组装和TCR报告系统，成功从宫颈癌患者已发表的单细胞RNA测序数据集中鉴定出一种针对HPV16的TCR，以及相应的抗原表位和HLA亚型。宫颈癌在全球女性中是继乳腺癌、结直肠癌和肺癌之后第四大常见癌症，也是导致女性癌症相关死亡的主要原因之一。它主要分为两种组织学类型：鳞状细胞癌和腺癌。超过95%的鳞状细胞癌与高危型HPV的持续感染有关，尤其是HPV16和HPV18。值得注意的是，HPV16被认为是高危型HPV中最具危险性的基因型，全球范围内相当比例的宫颈癌病例都与之相关。在持续感染的条件下，HPV通过复杂的分子机制逃避免疫监视，最终促进宫颈癌的发生发展。HPV来源的E6和E7蛋白在这一过程中发挥了关键作用。除了通过靶向p53和Rb等抑癌基因发挥致癌作用外，E6和E7还具有多种免疫抑制效应，不仅抑制核因子κB的活性，从而降低炎症细胞因子的表达，还通过下调信号转导与转录激活因子1的活性来抑制I型干扰素通路。此外，E6和E7还抑制DC细胞的分化和HLA-I类分子的表达，从而削弱向CD8+ T细胞呈递抗原的能力。因此，HPV来源的E6和E7蛋白具有核心地位，不仅作为宫颈癌临床诊断的重要生物标志物，同时也是开发免疫治疗策略的关键靶点。这里利用宫颈癌患者的单细胞测序数据鉴定出一种识别HPV16-E7蛋白来源肽段的TCR。其他大多数TCR可能识别的是与HPV16 E6和E7无关的肽段，这可能归因于宫颈癌肿瘤的异质性。在宫颈癌中，HPV主要通过其癌蛋白E6和E7驱动肿瘤发生。其他基因也普遍存在突变，例如KMT2D、CTCF、LRP2、CDK12和LRP1B。

除了有助于高效筛选特异性识别pHLA复合物的TCR之外，整合的抗原呈递、TCR组装和TCR报告系统还可用于对TCR进行基因工程改造以提高其亲和力，特别是通过对CDR3区域的修饰。通过在CDR3特定残基引入靶向突变，合成的寡核苷酸可被轻松克隆，从而构建TCR表达文库，用于进一步筛选和功能表征。该方法最大限度地发挥TCR筛选平台的潜力，推动TCR-T免疫治疗中TCR的发现与优化，最终促进癌症治疗的发展。

Wang X, et al. Integrated system for screening tumor-specific TCRs, epitopes, and HLA subtypes using single-cell sequencing data. J Immunother Cancer. 2025 Jul 31;13(7):e012029.

Moravec Z, et al. Discovery of tumor-reactive T cell receptors by massively parallel library synthesis and screening. Nat Biotechnol 2025;43:214-22.

Xiong C, et al. Identification of novel HLA-A*11:01- restricted HPV16 E6/E7 epitopes and T- cell receptors for HPV- related cancer immunotherapy. J Immunother Cancer 2022;10:e004790.

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