流式细胞术从零开始说

2025-08-06 09:56

流式细胞术从零开始说

流式细胞术（flow cytometery）是利用流式细胞仪（flow cytometer）对快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒等进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术，具有检测速度快、测量参数多、采集数据量大、分析信息全面、分选纯度高、方法灵活等特点，可用于细胞大小、细胞颗粒度、DNA及RNA含量、蛋白质含量、细胞特异抗原、细胞活性、胞内PH值、细胞周期、细胞凋亡、细胞功能分析等的检测。

64341754444696537 通过流式细胞术进行细胞凋亡分析abs50001 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒

FITC Annexin V 染色的流式细胞术分析。 Human PBMC用 12 uM 喜树碱处理 4 小时。将细胞与 FITC Annexin V 在含有碘化丙啶 (PI) 的缓冲液中孵育，并通过流式细胞术进行分析。经过 2 小时的处理，主要有三组细胞：活细胞（FITC Annexin V 和 PI 阴性）和凋亡早期（FITC Annexin V 阳性和 PI 阴性）和 FITC Annexin V 和 PI 双阳性的细胞。

流式细胞术的基本原理

深入了解流式细胞术的基本原理，必须了解流式细胞仪，流式细胞仪的基本元件包括液路系统、光路系统以及电子系统三个部分。

38751754444696872 液路系统：确保细胞单个排列通过，每次分析一个细胞。

光路系统：产生、收集、分离和转换光信号，为后续的数据分析提供基础。

电子系统：处理和保存由光学系统检测到的信号，并将这些信号转换为可用于分析的数字数据。

液路系统

液路系统的作用是将样品排列成单列细胞/颗粒流，并使细胞/颗粒稳定高速的通过流式细胞仪的检测点，主要包含流动室+鞘液+废液+上样器+压力控制系统。

36251754444697098 上样速度越高，样本中心液流（sample core）越粗，激光聚焦越差，分辨率越低；定性测量一般对流速要求不高，例如免疫分型；定量测量严格要求低速，例如细胞周期检测。

流式细胞中的光信号

1、散射光信号

散射光信号是细胞的固有参数，不需要使用荧光标签；

27951754444697379 前向散射光 (forward scatter)：FSC信号的强弱与细胞的大小相关；侧向散射光（side scatter)：SSC信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关；FSC-SSC的作用：利用细胞大小和颗粒度初步区分细胞群、去除细胞碎片、去除黏连细胞。

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从细胞进入激光照射区到离开，产生一个电脉冲信号。H是脉冲高度，代表脉冲信号的峰值；W是脉冲宽度，是指细胞通过激光照射区域的时间；A是脉冲信号的面积。

实际操作中，部分细胞与细胞会粘在一起，连续通过激光照射区，被仪器认定为一次信号，对我们最终的数据分析造成干扰。当粘连体出现测量高度不变，宽度和面积变为两倍，即出现FSC-Height不变，FSC-Area和Width增大的现象。

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我们可以使用FSC-A与FSC-H来排除粘连体，正常单细胞通过流式细胞仪激光照射区时，H和A是成正比增大的，而粘连体通过时，H不变，A增大，因此，可通过细胞的FSC-A（Area）与FSC-H（Height）参数完美排除掉粘连体，也可以通过FSC-H与FSC-W来操作，但此种方法对于复杂样本（样本中各种细胞大小差异较大）不太适用，实际上，去除粘连体的重要步骤在样本制备阶段。

2、荧光信号

在流式细胞术中，荧光信号的产生是由于特定的荧光素分子吸收一定波长的光后跃迁到激发态，然后释放光子（荧光）回到基态。了解荧光信号的产生以及各部分元件，有助于我们多色配色。 1141754444698402 激光：提供单色光束，用于激发细胞中的荧光标记物，常见激光器有355nm（紫外）、405nm（紫色）、488nm（蓝色）、561nm（黄绿色）、633nm（红色）。有的流式细胞仪只配备488nm；有的流式细胞仪配备两种激光器如488nm与638nm。多色流式则可能需要更多的激光器。