西农园艺学院DNA甲基化揭示苹果干旱胁迫的表观基因组调控机制

近日，西北农林科技大学园艺学院徐记迪副教授、管清美教授和塔里木大学王江波副教授团队合作，通过多组学分析揭示苹果在干旱胁迫下的表观基因组特征。研究综合运用全基因组重亚硫酸盐测序（Whole-Genome Bisulfite Sequencing, WGBS）、染色质免疫沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）和转录组测序（RNA-seq）技术的多组学整合分析，揭示了苹果在干旱处理不同时间点（0天、3天、6天和9天）的DNA甲基化、组蛋白修饰和基因表达变化。研究发现，干旱胁迫下苹果的基因表达、DNA甲基化和组蛋白修饰均发生显著变化，并鉴定出两个关键基因MdABI5和MdOCP3，其通过组蛋白修饰调控苹果抗旱性。相关研究成果以《An integrative multi-omics analysis of histone modifications and DNA methylation reveals the epigenomic landscape in apple under drought stress》为题发表于《Plant Biotechnology Journal》（IF:10.5）期刊。

标题：An integrative multi-omics analysis of histone modifications and DNA methylation reveals the epigenomic landscape in apple under drought stress（组蛋白修饰和DNA甲基化的综合多组学分析揭示了干旱胁迫下苹果的表观基因组谱）

发表时间：2025年07月07日

发表期刊：Plant Biotechnology Journal（PBJ）

影响因子：IF10.5/Q1

技术平台：WGBS、ChIP-seq、RNA-seq

作者单位：西北农林科技大学园艺学院徐记迪、管清美等

doi: 10.1111/pbi.70173

表观遗传调控在植物发育和逆境响应过程中发挥着关键作用。先前研究表明表观遗传修饰参与苹果干旱响应，但其干旱响应机制仍需要一个全面的表观基因组学来表征。本研究在干旱处理后0天、3天、6天和9天时，对苹果属植物湖北海棠（Malus hupehensis）进行了转录组测序、DNA甲基化（WGBS）和六种组蛋白修饰（H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3）的ChIP-seq分析。研究结果揭示在干旱处理后6天的差异表达基因变化最为显著。在干旱处理后3天基因区域周围DNA甲基化水平达到最高。在干旱处理下，六种组蛋白修饰的整体富集水平略有下降。上调的干旱响应基因中，具有较高变化倍数（fold changes）基因与H3K27me3低水平修饰相关，而具有较低变化倍数的上调基因则与H3K4me3高水平修饰相关。许多干旱响应基因（如MYB88、NCED3和JAZ1）受表观遗传修饰调控。研究验证了MdABI5（受H3K14ac和H3K27me3调控）和MdOCP3（受H3K9ac和H3K36me3调控）这两个受多种表观遗传修饰调控的候选干旱响应基因的功能。转基因苹果在干旱条件下的表型显示，MdABI5和MdOCP3正向调控苹果的抗旱性。本研究结果为表观遗传修饰的分子机制研究提供了新见解，并为提高苹果的抗旱性提供了理论依据。

研究方法

（1）植物材料与干旱处理：3月龄苹果（Malus hupehensis）幼苗，种植于温室中。干旱处理通过逐步减少土壤水分进行，分别在0天（A0d）、3天（A3d）、6天（A6d）和9天（A9d）取样。取样时，选取每株植物的第4-6片叶作为生物学重复样本。

（2）转录组测序（RNA-seq）：检测基因表达水平。

（3）全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）：分析全基因组水平的DNA甲基化状态。

（4）染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）：分析H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3六种组蛋白修饰水平。

（5）转基因植物构建与表型分析：将MdABI5和MdOCP3基因导入苹果GL-3品种中，构建过表达和RNA干扰转基因株系。通过PCR和RT-qPCR验证转基因株系，并在干旱条件下评估其表型和生理指标。

结果图形

（1）不同干旱处理下苹果的动态基因表达变化

研究通过转录组分析发现，在干旱处理3天（A3d）时，苹果中有3041个差异表达基因（DEGs），表明许多基因在干旱早期就已经响应。随着干旱时间延长，DEGs数量在6天（A6d）时达到峰值（3818个），9天（A9d）时略有下降（3816个）。基因表达趋势的聚类分析显示，大多数基因在A6d时表达量达到峰值，且与水分剥夺相关的基因在A6d时显著富集。研究还发现一些基因（如TIFY10A-like、XTH33、RPM1-like和PK1）在干旱处理过程中表达量持续上调或下调，这些基因可能在干旱响应中发挥重要作用。通过对不同表达趋势的基因组分析，结果表明其在缺水、激素响应、离子稳态和代谢过程等通路中显著富集，表明A6d是苹果干旱响应的关键阶段。

图1：转录组差异分析、聚类和功能富集结果。

• 湖北海棠（Malus hupehensis）在干旱处理0天、3天、6天和9天时的表型。

• 不同差异比较组合时期中的差异表达基因（DEGs）数量。

• 不同时期DEGs表达趋势的聚类分析。

• 干旱处理下相邻比较组合中DEGs的重叠情况。

• 不同表达趋势基因组的功能富集比较点图（第1组：Cluster 1，第2组：Cluster 3，第3组：Cluster 4，第4组：Cluster 5，第5组：Cluster 2、6、7和8）。

（2）苹果响应干旱胁迫的DNA甲基化图谱

研究通过WGBS技术分析了苹果在干旱处理下的DNA甲基化变化。结果显示，在干旱处理早期（A3d），基因区域附近的DNA甲基化水平显著增加，随后在A6d略有下降，A9d时又略有回升。表明DNA甲基化在干旱胁迫的早期阶段起着关键作用。研究还发现与对照组相比，干旱处理下苹果的mCG、mCHG和mCHH三种DNA甲基化类型均显著增加。此外研究分析了DNA甲基化与基因表达的相关性，发现差异甲基化区域（DMRs）与DEGs在A3d vs A0d、A6d vs A0d和A9d vs A3d的比较组中呈差异变化模式，这与DNA甲基化在启动子区域的抑制效应一致。研究还分析了DNA甲基化在全基因组水平的分布，发现mCHH在基因上游2000bp区域内的增加可能与RNA介导的DNA甲基化（RdDM）通路激活有关，但24nt siRNA的富集并未显著变化。这表明DNA甲基化水平变化可能受多种因子综合调控。

图2：WGBS、24nt siRNA分布以及与甲基转移酶变化对干旱响应的特征分析。

• 全基因组水平上genebody附近区域的DNA甲基化模式。

• 不同干旱比较组合下与高甲基化和低甲基化DMRs相关的基因数量。

• 不同比较组合在全基因组水平上每种甲基化类型分布的百分比。

• genebody区域附近24nt siRNA的富集情况。

• 在干旱处理下差异表达的DNA甲基化相关因子的表达模式。

（3）苹果响应干旱胁迫的组蛋白修饰变化图谱

研究通过ChIP-seq技术分析了六种组蛋白修饰（H3ac、H3K9ac、H3K14ac、H3K4me3、H3K27me3和H3K36me3）在干旱处理下的变化。结果显示，这些组蛋白修饰在基因区域和启动子区域的分布与基因表达调控密切相关。在干旱处理下，组蛋白修饰的整体水平略有下降，但某些基因区域修饰水平发生显著变化。如与对照组相比，A6d时H3K4me3、H3K9ac和H3K14ac水平略有下降，而H3K27me3水平则显著下降。研究还发现组蛋白修饰变化与基因表达变化之间存在一定相关性。如上调基因与H3K27me3低水平相关，而上调基因与H3K4me3高水平相关。这些结果表明，组蛋白修饰在苹果响应干旱胁迫过程中发挥着重要的调控作用。

图3：组蛋白修饰的特征分析及差异分析。

• 各种组蛋白修饰在基因区域周围的分布情况。

• 在干旱处理下差异表达的组蛋白修饰相关因子的表达模式。

• 受组蛋白修饰调控的干旱响应基因的重叠情况。

• 干旱处理下组蛋白修饰富集偏好基因的功能分析。

（4）组蛋白修饰和DNA甲基化变化对干旱响应中基因表达变化的作用

研究分析了DNA甲基化和组蛋白修饰在干旱响应中的协同作用。结果显示，虽然在全基因组水平上DNA甲基化与组蛋白修饰分布并无明显协同效应，但在某些基因的转录调控中，两种表观遗传修饰可能互作。例如，研究发现与对照组相比，A6d时有40.9%的DEGs受组蛋白修饰调控，其中H3K4me3调控基因数量最多。研究还发现，DNA甲基化和组蛋白修饰在调控基因表达方面存在一定偏好性。例如上调基因中，低倍数变化基因主要受H3K4me3调控，而高倍数变化基因则主要受H3K27me3低水平调控。这些结果表明，DNA甲基化和组蛋白修饰在苹果干旱响应中通过复杂机制调控基因表达。

图4：六种组蛋白修饰、DNA甲基化及其在干旱处理下的调控功能之间相关性。

• 由DNA甲基化和组蛋白修饰共同调控的差异表达基因以及这些调控基因表达变化的Upset图。所有受表观遗传修饰调控的上调和下调DEGs与表观遗传修饰、log2（变化倍数）和组蛋白修饰之间的关系热图。红色表示与表观遗传修饰呈正相关，而蓝色表示负相关。

• 受不同表观遗传修饰调控的基因的功能富集表。红色表示在GO通路中显著富集，白色表示不显著。

（5）组蛋白修饰调控的MdABI5正向调控苹果抗旱性

研究发现，MdABI5基因在干旱胁迫下表达上调，且其上游的H3K14ac水平增加，H3K27me3水平降低。通过构建MdABI5过表达（MdABI5-OE）和RNA干扰（MdABI5-RNAi）转基因植株，研究发现MdABI5正向调控苹果抗旱性。在干旱条件下，MdABI5-OE植株表现出更高的存活率、更低的离子渗漏率和更高的相对含水量，表明其抗旱性增强。而MdABI5-RNAi植株表现出更高的离子渗漏率和更低的存活率，表明其抗旱性减弱。这些结果表明，MdABI5通过组蛋白修饰调控苹果抗旱性。

图5：MdABI5过表达（MdABI5-OE）增强苹果抗旱性。

• 湖北海棠（Malus hupehensis）在不同土壤含水量下干旱处理时MdABI5的表达情况。

• 干旱处理和对照条件下MdABI5上游H3K14ac和H3K27me3的基因组浏览器快照。

• ABI5上游组蛋白修饰的ChIP-qPCR验证。

• 在DNA水平上鉴定MdABI5-OE转基因植株。

• 在RNA水平上鉴定MdABI5-OE植株。

• GL-3（野生型）和MdABI5-OE转基因植株的表型。

• 图（f）中GL-3和三条独立的MdABI5-OE株系存活率。

• GL-3和MdABI5-OE植株在干旱处理下的叶片离子渗漏测定。

• GL-3和MdABI5-OE植株在干旱下的叶片相对含水量（RWC）。

• GL-3和MdABI5-OE植株的离体叶片在25°C下的水分丢失。

• GL-3和MdABI5-OE植株在干旱处理下的光合速率分析。

• GL-3和MdABI5-OE植株在干旱处理下的过氧化氢酶（CAT）活性。

• GL-3和MdABI5-OE植株在干旱处理下的过氧化氢（H2O2）含量。

图6：MdABI5的RNA干扰（MdABI5-RNAi）降低苹果抗旱性。

• 在DNA水平上鉴定MdABI5-RNAi转基因植株。

• 在RNA水平上鉴定MdABI5-RNAi植株。

• GL-3和MdABI5-RNAi转基因植株的表型。

• 图（c）中GL-3和两条独立的MdABI5-RNAi株系的存活率。

• GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱处理下的叶片离子渗漏测定。

• GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱下的叶片RWC。

• GL-3和MdABI5-RNAi植株的离体叶片在25°C下的水分丢失。

• GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱处理下的光合速率分析。

• GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱处理下的CAT活性。

• GL-3和MdABI5-RNAi植株在干旱处理下的H2O2含量。

（6）组蛋白修饰调控的MdOCP3正向调控苹果抗旱性

研究发现，MdOCP3基因在干旱胁迫下表达下调，且其上游的H3K9ac和H3K36me3水平降低。通过构建MdOCP3过表达（MdOCP3-OE）和RNA干扰（MdOCP3-RNAi）转基因株系，研究发现MdOCP3正向调控苹果的抗旱性。在干旱条件下，MdOCP3-OE株系表现出更高的存活率、更低的离子渗漏率和更高的相对含水量，表明其抗旱性增强。相反，MdOCP3-RNAi株系则表现出更高的离子渗漏率和更低的存活率，表明其抗旱性减弱。这些结果表明，MdOCP3通过组蛋白修饰调控苹果的抗旱性。

图7：MdOCP3过表达（MdOCP3-OE）增强苹果抗旱性。

• 湖北海棠（Malus hupehensis）在不同土壤含水量下干旱处理时MdOCP3的表达情况。

• 干旱处理和对照条件下MdOCP3上游H3K9ac和H3K36me3的基因组浏览器快照。

• OCP3上游组蛋白修饰的ChIP-qPCR验证。

• 在DNA水平上鉴定MdOCP3-OE转基因株系。

• 在RNA水平上鉴定MdOCP3-OE株系。

• GL-3和MdOCP3-OE转基因植株的表型。

• 图（f）中GL-3和两条独立的MdOCP3-OE株系的存活率。

• GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱处理下的叶片离子渗漏测定。

• GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱下的叶片相对含水量（RWC）。

• GL-3和MdOCP3-OE植株的离体叶片在25°C下的水分丢失。

• GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱处理下的光合速率分析。

(l-n) 检测GL-3和MdOCP3-OE植株在干旱处理下的过氧化氢酶（CAT）(l)、过氧化物酶（POD）(m)和丙二醛（MDA）(n)含量。

(o) 采用DAB染色检测GL-3和MdOCP3-OE中的H2O2含量。

图8：MdOCP3的RNA干扰（（MdOCP3-RNAi））降低了苹果的抗旱性。

• 在DNA水平上鉴定MdOCP3-RNAi转基因株系。

• 在RNA水平上鉴定MdOCP3-RNAi株系。

• GL-3（野生型）和MdOCP3-RNAi转基因植株的表型。

• 图（c）中GL-3和三条独立的MdOCP3-RNAi株系存活率。

• GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱处理下的叶片离子渗漏测定。

• GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱下的叶片相对含水量（RWC）。

• GL-3和MdOCP3-RNAi植株的离体叶片在25°C下的水分丢失。

• GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱处理下的光合速率分析。

(i-k）检测GL-3和MdOCP3-RNAi植株在干旱处理下的过氧化氢酶（CAT）(i)、过氧化物酶（POD）(j)和丙二醛（MDA）(k)含量。

(l) 采用DAB染色检测GL-3和MdOCP3-RNAi中的H2O2含量。

（7）表观遗传修饰在干旱调控网络中的作用

研究分析了表观遗传修饰在干旱响应网络中的作用。通过注释已知的干旱响应基因，研究发现许多基因受DNA甲基化和组蛋白修饰调控。例如，在ABA信号通路中，关键基因（如PYLs、PP2C、SnRKs和RAFs）受组蛋白修饰调控。与钙离子通路和激酶级联反应相关的基因（如CIPKs和CPKs）也受表观遗传修饰调控。这些结果表明，表观遗传修饰在苹果干旱响应的信号和基因表达调控中发挥着重要作用。

图9：植物对干旱胁迫的感知、信号传导以及ABA依赖和非依赖的转录调控网络。

• 植物中与干旱胁迫感知和信号传导相关的因子的表观遗传修饰注释。TFs数量指在整个干旱过程中差异表达的所有转录因子（TFs）。

(b-c) 通过表观遗传修饰注释的ABA依赖和ABA非依赖调控网络。星形代表受组蛋白乙酰化修饰调控的DEGs，正方形代表受组蛋白甲基化修饰调控的DEGs，三角形代表受DNA甲基化修饰调控的DEGs。不同颜色代表不同类型的修饰。

图10：表观遗传因子及表观遗传调控基因的基因组快照和表达验证。

• 基因组浏览器快照显示6天干旱处理和对照中转录本水平与DNA甲基化和组蛋白修饰之间的关系。

• 在不同土壤含水量干旱处理下，受表观遗传修饰调控的基因和干旱响应的表观遗传因子的十个差异表达基因的RT-qPCR结果。

结论和启示

本研究通过多组学分析揭示了苹果在干旱胁迫下的表观遗传调控机制，特别是DNA甲基化和组蛋白修饰在基因表达调控中的作用。研究发现，DNA甲基化和组蛋白修饰在苹果干旱响应中通过复杂的机制调控基因表达，且两个关键基因MdABI5和MdOCP3通过组蛋白修饰正向调控苹果的抗旱性。这些发现为理解植物抗旱的分子机制提供了新的视角，并为通过表观遗传修饰改良苹果抗旱性提供了理论基础。

WGBS、ChIP-seq和RNA-seq技术在本研究中发挥了重要作用，不仅揭示了全基因组水平的表观遗传变化，还为解析基因表达调控机制提供了有力工具。这些技术的综合应用为未来类似植物抗逆研究提供了方法学参考。