脾脏单细胞悬液制备指南（酶解法）

小鼠脾脏是一个重要的免疫器官，位于小鼠左侧腹腔中，靠近胃的左侧，呈长椭圆形状。大小会根据小鼠的品种和健康状况有所不同，一般来说，成年小鼠的脾脏长度大约在1.5厘米到2.5厘米之间。脾脏的颜色和质地可能会因为小鼠的品种和健康状况而有所变化，通常呈现出类似叶片的形态，颜色暗红。在实验研究中，小鼠脾脏细胞的分离、培养和计数是免疫学研究的重要方法，也是流式细胞术分析的前提。

实验步骤

实验前准备：将脾脏小鼠脾脏组织解离试剂盒至于37度水浴锅中预热（脾脏组织解离试剂收到后，推荐分装冻存），如果使用红细胞裂解液为10×，需提前用超纯水稀释成1×。PBS提前预冷。

1、将小鼠颈部脱臼处死，75%酒精消毒小鼠表面，至于托盘中，左侧腹部朝上，镊子辅助操作，提起左腹侧中部皮肤，剪开皮肤，肉眼可见暗红色，长条状脾脏，剪开腹膜，镊子提起脾脏，见到分离，尽可能的除去结缔组织和脂肪，PBS冲洗，取新鲜小鼠脾脏组织100mg-200mg左右（一个20g的小鼠，脾脏重量可能在100mg左右，具体以实际情况为准）加至50mL无菌离心管中，用眼科剪将组织彻底剪碎至1-2mm3，加入小鼠脾脏组织解离试剂1mL；

2、将离心管置于恒温摇床上，37℃/180rpm震荡孵育30min左右，消化小鼠脾脏组织，可根据组织状态适当调整消化时间（脾脏相对比较好消化），混悬液中肉眼无明显组织块时，取少量悬液倒置显微镜下观察，可辅助判断，有大量活细胞即可停止消化（中心明亮），也可用台盼蓝染色或者其他方式；

红色圈内：死细胞 绿色圈内：活细胞

3、孵育结束后将离心管内的组织匀浆用70um无菌过滤器过滤，然后加入细胞培养基冲洗无菌过滤器，用50mL的离心管收集滤液；

4、将收集的滤液1200rpm离心5min ，弃上清；

5、可使用红细胞裂解液去除组织解离过程中的红细胞，具体操作为，向第4步所得的沉淀加入3mL 1×红细胞裂解液，重悬沉淀，涡旋混匀，室温下避光孵育3-5min，加入2mL预冷的PBS, 1200rpm离心 5min，弃上清。重复洗涤一次；

6、弃上清，细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至5-10×106个细胞/mL，将100uL/管的细胞悬液分配到12×75mm的流式管中，进行后续实验。

问题及策略

1、细胞得率低

一般情况下，成年C57BL/6小鼠一个脾脏可解离出大约10×108-1.4×108个细胞，如果发现细胞得率特别低，需要注意，样本获取阶段要尽可能完全去除组织周围的脂肪，尽可能将组织剪碎，从而提高细胞产量。在涉及的清洗步骤中，倒出上清液前，先用移液枪吸弃上层脂肪（可将枪头尖端修剪一下，避免吸气时堵塞）。

2、细胞活率低，死细胞/碎片多

首先，解离试剂孵育的时间不能过长，长时间孵育会造成细胞活力降低及表面标记物丢失，死细胞过多，释放DNA丝缠绕，导致溶液粘稠，其次，千万不要缩短清洗的步骤，清洗可以帮助去除粘连体、碎片和死细胞，红细胞裂解液的孵育时间也不能过长，一般5min即可，如果细胞活力还是很低，建议检查红细胞裂解液是否新鲜有效。

3、红细胞裂解不完全

表现为洗涤步骤后出现明显的红色沉淀。确保制备新鲜的红细胞裂解缓冲液，在室温下进行裂解。裂解开始前，要确保细胞已完全重悬，裂解时间不能过短。

解离效果

小鼠Spleen组织处理为单细胞悬液后做流式：细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果