mRNA电穿孔与慢病毒转导的HBV TCR-T细胞治疗

这里初步评估在肝移植后复发的HBV相关肝细胞癌（HBV-HCC）患者中，采用mRNA电穿孔与慢病毒转导相结合的HBV特异性TCR-T细胞治疗的安全性、耐受性及抗肿瘤疗效。在这项中山大学附属第一医院和Lion TCR公司的试点研究（NCT04677088）中，在未进行预先淋巴细胞清除的情况下评估了两种类型的自体HBV特异性TCR-T细胞：① 多次输注mRNA电穿孔的HBV-TCR-T细胞（mRNA-HBV-TCR-T细胞）；② 一至三次输注慢病毒转导的HBV-TCR-T细胞（lenti-HBV-TCR-T细胞）。采用不良事件通用术语标准（CTCAE）评估治疗相关的不良事件，根据RECIST 1.1标准通过CT扫描评估抗肿瘤疗效。无进展生存期（PFS）定义为从研究治疗开始至出现客观肿瘤进展或死亡的时间。mRNA电穿孔和慢病毒转导的HBV特异性TCR-T细胞均表现出良好的安全性，仅观察到1至2级治疗相关不良事件。在mRNA-HBV-TCR-T细胞组中，中位PFS为2.32个月（1.87-2.77个月）。联合治疗组（mRNA-HBV-TCR-T细胞+ lenti-HBV-TCR-T细胞）的中位PFS为7.34个月（4.47至7.60个月）。CT影像显示联合治疗组具有有效的肿瘤控制效果。研究初步表明，在终身免疫抑制剂治疗背景下，mRNA-HBV-TCR-T细胞与lenti-HBV-TCR-T细胞联合治疗可能是一种安全且潜在有效的肝移植后患者治疗方案。仍需进一步研究以优化治疗策略，并评估这种特殊患者群体中的长期安全性和疗效。

HCC是成人中最常见的原发性肝癌类型，仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一。慢性HBV感染是主要的致病因素，约占全球HCC病例的一半。随着从肝炎发展为肝硬化并最终演变为癌症，HCC患者的肝功能常常恶化至不可逆的终末期阶段，使得肝移植（LT）成为唯一有效的根治性治疗手段。然而，术后肿瘤复发率高达40%-60%，治疗选择非常有限。移植后复发（PTR）通常表现为广泛转移，在超过50%的病例中累及肺、肝、骨、淋巴结和肾上腺等多个器官。该状况预后较差，自诊断之日起中位生存期不足一年。PTR的长期缓解极为罕见，目前尚无标准治疗药物用于肝移植后复发的肝癌，这突显了迫切需要创新的治疗策略来应对肝移植受者中HBV-HCC的复发问题。

2024年，美国FDA批准了首个用于治疗实体瘤的TCR-T疗法。TCR-T疗法的成功取决于靶向抗原的合理选择，这些抗原大致可分为三类。肿瘤相关抗原在肿瘤组织和正常组织中均有表达，因而存在脱靶毒性的风险。肿瘤特异性新抗原由突变的肿瘤细胞基因编码，具有更高的特异性，但由于肿瘤异质性而适用性受限。病毒抗原，尤其是在病毒相关肿瘤中，是理想的靶标，因为它们具有更强的免疫原性、特异性和通用性。因此，靶向HBV抗原的TCR-T细胞疗法在HBV-HCC的治疗中展现出巨大的潜力。引入的HBV特异性TCR由通过二硫键连接的α链和β链组成，在识别HCC细胞呈递的HBV表位后，可激活内源性信号通路，进而启动细胞毒性蛋白释放、细胞因子产生及对肿瘤细胞的杀伤作用。

自体mRNA电穿孔HBV-TCR-T细胞在晚期原发性HBV-HCC患者中的安全性和潜在疗效已得到证实。使用功能上短暂表达的mRNA TCR-T细胞通过限制TCR的长期表达，从而提供了一种更为安全的治疗策略，降低了持续性的"on-target-off-tumor"肝脏毒性风险。这一点对于原发性HBV-HCC患者尤为重要，因为靶向正常HBV感染肝细胞的风险仍是一个安全方面的顾虑。考虑到这些患者的肝功能可能已经受损，保护肝功能并防止进一步损伤也是关键的考量因素。然而，由于TCR表达时间较短，可能需要重复给药以实现治疗效果。

相比之下，在肝移植后复发性HCC的情况下，移植肝脏与患者自身免疫系统之间的HLA不匹配使得长期表达TCR不太可能引起显著的肝毒性。这是因为HBV-TCR-T细胞会选择性地攻击非HBV感染器官中的HBV-HCC肿瘤，而非HBV感染的肝脏。此外，保持TCR-T细胞的功能对其临床疗效至关重要，特别是在LT后的免疫抑制环境中。在器官移植受者中实施免疫治疗的一个主要挑战在于，移植后的免疫抑制方案可能会削弱T细胞治疗的效果。在肝移植的情况下，维持免疫抑制治疗通常从单独使用Tacrolimus或联合MMF开始，并持续终生。这些药物的设计目的是广泛抑制T细胞介导的免疫反应，以防止移植物排斥反应。已有研究表明，即使短期接触这些免疫抑制药物，也会显著损害T细胞的功能和迁移能力。

稳定的基因修饰方法（如逆转录病毒和慢病毒转导）已被广泛应用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤的过继性T细胞治疗。研究表明，在肝移植后复发性HCC患者中，即使单次输注低至1.2 x 10^4细胞/kg剂量的逆转录病毒转导HBV-TCR-T细胞，仍可诱导系统性IFN-γ和IL-8释放，并具有可控的安全性。在肝移植患者中使用慢病毒转导HBV-TCR-T细胞治疗的一个关键安全性优势在于，由于移植肝脏与受体之间常见的HLA不匹配，HBV-TCR-T细胞能够选择性地识别患者自身HLA-I类分子呈递的HBV抗原。这种选择性降低了靶向移植肝脏中肝细胞的风险，从而减少了HBV-TCR-T细胞输注后因TCR持续表达而引发肝脏损伤的可能性。

然而，使用病毒载体进行稳定的遗传修饰会引发对持续免疫激活的担忧，这可能会增加慢性炎症的风险，并可能引起移植受者的器官排斥反应。由此提出了一个关键问题：在这一患者群体中，病毒转导后HBV-TCR-T细胞的长期持续存在是否具有可接受的风险获益特征。此外，在TCR-T细胞输注之前需要进行淋巴清除化疗，这带来了进一步的安全性考虑，例如全血细胞减少、感染风险增加以及免疫重建延迟，所有这些都必须在这些免疫功能受损的患者中密切监测。相比之下，mRNA HBV-TCR-T细胞不需要预先进行淋巴清除，从而避免了这些副作用，提供了更安全的选择。

尽管存在这些挑战，评估稳定表达HBV-TCR的可行性仍然至关重要，因为延长患者的生存期是癌症治疗的黄金标准。对于肝移植后复发的HBV-HCC患者来说，这一点尤其紧迫，因为目前全球监管机构尚未批准有效的标准治疗方案，导致治疗选择极为有限。在这里，从一个由Lion TCR公司提供的、受不同HLA-I类分子限制的HBV特异性TCR文库中，筛选出了可靶向HBV表面抗原（HBsAg）或核心抗原（HBcAg）的HLA匹配型TCR。随后，采用两种不同的方法将这些TCR导入自体T细胞中：一种是通过mRNA电穿孔技术生成暂时表达的mRNA-HBV-TCR-T细胞，另一种则是通过慢病毒转导产生稳定修饰的lenti-HBV-TCR-T细胞。

患者被分别纳入3个队列（每个队列N=2，共6名患者）。队列1的患者接受了多次mRNA电穿孔T细胞（mRNA-HBV-TCR-T细胞）输注。在确认其安全性后，队列2患者接受了多次mRNA-HBV-TCR-T细胞输注，随后接受慢病毒转导T细胞（lenti-HBV-TCR-T细胞）输注。队列3患者则先接受一次mRNA-HBV-TCR-T细胞输注，之后接受lenti-HBV-TCR-T细胞输注。评估了HBV-TCR-T细胞疗法在肝移植后复发的HBV-HCC患者中的安全性，并探索其治疗效果。

详细的研究计划见图1。从患者体内采集全血并送至符合GMP标准的细胞治疗实验室，在该实验室中分离PBMC，激活并扩增T细胞，随后进行mRNA电穿孔或慢病毒转导，最终获得细胞产品（图2）。每位患者接受的治疗方案见表S2。

图1 HBV-TCR-T细胞治疗输注剂量和时间安排的示意图。

图2 HBV-TCR-T细胞生产流程的示意图。

表S2 接受HBV-TCR-T细胞治疗的患者总结

患者特征

从2018年5月8日至2019年7月5日，共有7名患者入组。其中一名患者因HCC病情恶化在治疗开始前退出。共有6名患者（4名男性和2名女性）接受了治疗。6名患者的中位年龄为45岁（26至57岁）（表S1）。所有6名患者均因HBV相关性肝细胞癌接受了肝移植，并正在接受免疫抑制药物治疗。肝移植后肿瘤复发的中位时间为约7.85个月。患者2、5和6分别接受了局部区域和系统性治疗，包括经导管动脉化疗栓塞术（TACE）、微波消融和Lenvatinib治疗。所有患者在整个研究期间均接受了抗乙肝病毒治疗。其中1名患者处于BCLC分期B期，其余5名患者均处于C期。研究期间，这些患者未接受其他抗肿瘤治疗。患者2在末次输注后第210天因转移性肿瘤及癌症恶病质导致的呼吸/循环衰竭死亡；患者3、4、5和6则分别因开始新的抗肿瘤治疗在第118天、第54天、第83天和第160天退出试验。

表S1 所有接受治疗患者的基线特征

安全评估

在本试验中观察到的所有不良事件（AEs）及其严重程度分级详见表1。2名患者出现了1-2级白细胞减少症，3名患者则出现了1-2级肌酸激酶升高。研究治疗期间报告的其他不良事件包括血小板减少症、上呼吸道感染、失眠以及胸部针刺样刺痛感，这些不良事件在因HBV-HCC接受肝移植后接受免疫抑制剂和抗乙肝病毒核苷类似物治疗的患者中较为常见。因此，将上述不良事件明确归因于研究治疗仍存在困难。此外，患者1出现的2级上呼吸道感染可能与免疫抑制有关，这与同时出现的白细胞减少症相符。同时，考虑到此前报道的mRNA电穿孔递送方法导致的TCR表达可持续达三天之久（10.1038/mtna.2013.43），将mRNA-HBV-TCR T细胞输注2-3天后出现的不良事件单纯归因于T细胞治疗也存在困难。这些不良事件可能受到伴随药物或患者基础HCC病情的影响。

表1 与HBV-TCR-T细胞治疗相关的可能不良反应

值得注意的是，所有不良事件均为暂时性且无需干预即可自行缓解。患者2和患者6未出现任何不良事件。此外，ALT、AST、TBIL和ALB水平均未显著偏离正常参考范围（图3，图S2），表明在接受HBV-TCR-T细胞治疗后，所有患者均未出现免疫排斥反应。具体到患者4，其在接受慢病毒HBV-TCR-T细胞首次输注后出现了轻微的肝酶升高（ALT 112 U/L，AST 110 U/L），但肝酶水平在15天内完全恢复正常，且未使用保肝药物。然而，在10天后，患者4的肝酶再次出现轻微升高（ALT 78 U/L，AST 177 U/L）。在此期间，患者发生了感染，因此肝酶升高被认为与感染导致的器官功能障碍有关。治疗期间，患者4和患者5的ALB水平出现了一过性下降。然而，如图S2J和S2K所示（展示了HBV-TCR-T细胞输注时间点与ALB水平变化趋势），这种下降无法明确归因于TCR-T治疗。

研究治疗及随访期间，所有患者均未出现CRS或ICANS等严重不良事件。这一结果得到了治疗阶段中炎症趋化因子（CXCL-9 和 CXCL-10）以及促炎细胞因子（IL-6、IL-18 和 TNF-α）水平保持稳定的支撑（图4）。这些发现为治疗方案的安全性和耐受性提供了有力证据。综上所述，这些数据表明，mRNA-HBV-TCR-T 细胞单独使用或与 lenti-HBV-TCR-T 疗法联合使用，在肝移植后复发的 HBV-HCC 患者中均具有良好的安全性和耐受性。

图3 HBV-TCR-T细胞治疗期间不同时间点肝损伤标志物（ALT、AST）的变化。

图S2 HBV-TCR-T细胞治疗期间不同时间点肝功能指标（TBIL、ALB）的变化。

图4 HBV-TCR-T细胞治疗过程中不同时间点炎症细胞因子水平的变化。

HBV-TCR-T细胞在体内的功能

如图5A-B所示，在仅接受mRNA-HBV-TCR-T细胞输注的患者1和患者2体内未检测到IFN-γ阳性T细胞。这可能是由于mRNA HBV-TCR的瞬时表达特性，在输注后72h内便失去了HBV特异性功能。同样，在联合治疗组（患者3、4以及患者5、6）中，在仅给予mRNA-HBV-TCR-T细胞的阶段，也未检测到分泌IFN-γ的T细胞（图5C-F）。然而，除了患者5之外，在输注了lenti-HBV-TCR-T细胞后，可以检测到IFN-γ阳性的HBV-TCR-T细胞，并可持续维持达61天之久，这是由于慢病毒转导促使T细胞长期稳定表达针对HBV抗原的TCR（图5C-F）。

图5 HBV-TCR-T细胞在外周血中的活动情况在不同时间点的变化。黑色垂直虚线表示mRNA-HBV-TCR-T细胞的输注时间点，红色垂直虚线表示lenti-HBV-TCR-T细胞的输注时间点。

疗效评估

每位患者的中位PFS时间和目标肿瘤病灶大小分别见表2和图S1。单独接受mRNA-HBV-TCR-T治疗的患者1和患者2出现了肿瘤进展，而联合治疗组中的所有患者（患者3、4和患者5、6）均显示出肿瘤稳定。

接受mRNA转染HBV-TCR-T细胞治疗的患者，其PFS中位数为2.32个月（1.87至2.77个月），而联合治疗组患者的PFS中位数为7.34个月（4.47至7.60个月）。这些数据表明，对于肝移植后复发的HCC，联合治疗可能是一种有前景的治疗选择。此外，数据还显示，基于慢病毒载体的HBV-TCR-T治疗可能对长期伴随使用的免疫抑制药物具有更好的耐受性，这类药物在临床上用于预防器官移植后的移植物排斥反应。相比之下，mRNA转染的HBV-TCR-T细胞似乎对免疫抑制药物更为敏感，这些药物可能会削弱输注T细胞的功能，从而限制其临床疗效。

在采用不同给药方案的两个联合治疗组（队列2和队列3）中，观察到患者5和患者6的目标肿瘤直径有所缩小（图S1）。值得注意的是，患者6的PFS最长，CT影像显示，在接受HBV-TCR-T首次输注后第179天，其目标肿瘤大小保持稳定（图S1F）。

表2 患者对HBV-TCR-T治疗的反应总结

图S1 HBV-TCR-T细胞输注过程中不同时间点目标病灶的CT影像。第0天标记为HBV-TCR-T治疗的开始。

总结

在本项研究中，研究人员对两种类型的HBV-TCR T细胞--mRNA-HBV-TCR T细胞和lenti-HBV-TCR T细胞进行了研究。共有6名患者参与，他们接受了2至17次输注，总共输注了9×10^7至3.6×10^9个HBV-TCR-T细胞。试验期间，所有患者均未出现任何严重的治疗相关不良事件。研究中也未观察到CRS或神经毒性反应，表明HBV-TCR-T细胞疗法具有良好的安全性。重要的是，这些经过修饰的自体T细胞能够特异性靶向HBV-HCC肿瘤细胞，而不会损害移植肝脏中的肝细胞，这是因为在接受过肝移植的患者中，肝细胞的HLA配型不匹配。这表明，对于缺乏有效标准疗法的这一患者群体，自体HBV TCR-T细胞疗法是一种安全的治疗方式。理论上，大多数与HBV相关的肿瘤细胞都表达HBV抗原肽，而来自供体的移植肝细胞则不带有HBV。作为肝移植术后标准护理的一部分，HBV-HCC患者通常会接受抗HBV药物和HBV免疫球蛋白，以降低移植肝脏发生HBV感染的可能性。此外，即使发生了HBV感染，肝脏是一个具有免疫耐受特性的器官，因此在供体与受体之间不需要严格的HLA配型。因此，由于HLA不匹配，自体HBV-TCR-T细胞不大可能识别移植肝脏中的HBV抗原-HLA复合物，从而最大程度地降低了移植物相关性肝毒性风险。

初始使用mRNA电穿孔技术进行TCR递送，可在最大程度降低安全性风险的同时提供持久的治疗效果。通过给予mRNA-HBV-TCR-T细胞疗法，可以密切监测与TCR表达相关的潜在不良事件，从而为后续采用慢病毒HBV TCR-T细胞疗法的治疗决策提供指导。从可扩展性和生产角度来看，使用mRNA技术也便于拓展适应症。通过将编码不同TCR的mRNA序列克隆到质粒载体中，可以根据各种治疗应用或疾病靶点来定制TCR谱系。只需替换已克隆的TCR mRNA序列，便可使表达的TCR识别并结合不同的抗原，实现疗法的快速再定向，以应对多种疾病或特定的免疫反应。这种灵活性有助于加快基于TCR的疗法的开发与优化。

对于原发性HCC而言，靶病灶通常位于肝脏这一重要器官。由于mRNA具有短暂表达的特性，mRNA HBV TCR-T细胞疗法非常适合这一应用场景。mRNA HBV TCR-T在原发性HBV-HCC患者中的安全性和有效性已在研究中得到验证。然而，在肝移植术后的情况下，常规联合使用的免疫抑制方案可能会削弱T细胞治疗的效果。移植后患者需终生服用Tacrolimus单药或联合MMF。这些药物的设计目的是广泛抑制T细胞介导的免疫反应，以防止移植物排斥反应。已有研究表明，即使短期接触这些药物也会显著影响T细胞的功能和迁移能力，从而对T细胞治疗的临床效果产生不利影响。

在这里，证实了mRNA HBV-TCR-T细胞与lenti-HBV-TCR-T细胞联合治疗可产生良好的疗效。4名患者在接受mRNA-HBV-TCR-T细胞治疗后，接受了经慢病毒转导的HBV-TCR-T细胞（4-15.5×10^7个细胞）治疗。没有观察到移植物排斥反应，这4名患者均实现了疾病稳定。然而，根据SD评估，sorafenib（肝细胞癌一线治疗药物）仅对少数因HBV导致的肝细胞癌复发而接受肝移植的患者有效。2015年的一项研究显示，大多数情况下疾病保持稳定（46.5%），而相当数量的患者（37%）出现了疾病进展。接受联合治疗（mRNA-HBV-TCR-T细胞 + lenti-HBV-TCR-T细胞）的4位患者的中位PFS为7.34个月，超过了香港玛丽医院2015年分析报告中评估sorafenib用于肝移植后肝细胞癌复发患者所报道的6.21个月的中位PFS。2017年，UHN的一项研究报道，使用sorafenib治疗的24例肝移植后肝细胞癌复发患者的中位疾病进展时间为4.3个月。此外，最近一项在土耳其11家肿瘤中心开展的回顾性研究评估了sorafenib和regorafenib在73名具有相同适应证患者中的疗效。作为一线治疗使用的索拉非尼中位无进展生存期为5.6个月，而作为二线治疗使用的瑞戈非尼中位无进展生存期为5.9个月。这些数据突显了mRNA-HBV-TCR-T细胞与lenti-HBV-TCR-T细胞联合治疗在这一适应证中的潜力，因为目前尚缺乏有效的治疗方法。值得注意的是，减少总的HBV-TCR-T细胞剂量并未影响治疗效果，突显了这种联合方法的可行性和有效性。

在接受仅mRNA-HBV-TCR-T治疗的患者中，免疫抑制药物可能会损害mRNA-TCR-T细胞的功能，从而限制其治疗效果。这一观察结果与先前在相同适应症中报道的一项研究一致。为了克服免疫抑制方案的免疫抑制效应，已开发出免疫抑制药物耐受装甲（IDRA）HBV导向的TCR-T细胞，这些细胞通过引入编码HBV特异性TCR的mRNA，以及钙调神经磷酸酶亚基B（CnB）和肌苷-5'-单磷酸脱氢酶（IMPDH）的突变形式来实现，这两种蛋白均为常用免疫抑制药物的作用靶点。由于mRNA表达是短暂的，在体内，这些经过修饰的T细胞的功能持续时间通常仅为约3-5天，之后它们将恢复原有的特异性，并重新对免疫抑制药物敏感。未来的研究有必要进一步探索使用IDRA HBV导向的TCR-T细胞的可行性。

虽然慢病毒转导能够实现TCR的稳定表达，从而增强长期疗效，但其应用也带来了一些安全性方面的考量，特别是关于继发性肿瘤发生以及TCR长期表达可能引发的不可控免疫相关毒性。此外，在TCR-T细胞输注前需要进行淋巴细胞清除性化疗，这也带来进一步的安全性问题，包括血细胞减少、感染风险增加以及免疫重建延迟，这些问题对于已经接受免疫抑制治疗的肝移植后患者尤其重要。然而，mRNA形式的HBV-TCR-T细胞不需要预先进行淋巴清除，避免了这些副作用，因此在此背景下具有更高的安全性。在肝移植后HBV-HCC复发的情况下，由于存在HLA不匹配的肝脏移植物，HBV-TCR-T细胞能够选择性地靶向HBV感染的肿瘤细胞，而非正常肝组织，从而降低了对移植物产生毒性的风险。这种靶向性表明，尽管存在上述挑战，通过慢病毒转导的HBV-TCR-T细胞仍然是移植后肿瘤复发的一种可行治疗选择。

总体而言，这里研究结果表明，联合使用mRNA转染和慢病毒转导的HBV-TCR-T细胞不仅保持了良好的安全性特征，还初步显示出对肝移植后复发的HBV相关肝细胞癌（需终身使用免疫抑制剂）具有潜在的抗肿瘤疗效。重要的是，移植肝脏与受体免疫系统之间的HLA不匹配降低了靶向但非肿瘤毒性反应的可能性，与用于原发性肝细胞癌治疗相比，进一步增强了该方法的安全性。

Zhao Q, et al. HBV-Specific TCR-T Cell Therapy Combining mRNA Electroporation and Lentiviral Transduction: Treatment Regime for Recurrent HBV-Related HCC Post-Liver Transplantation. Clin Cancer Res. 2025 Jul 24.

Yang F, et al. Messenger RNA electroporated hepatitis B virus (HBV) antigen-specific T cell receptor (TCR) redirected T cell therapy is well-tolerated in patients with recurrent HBV-related hepatocellular carcinoma post-liver transplantation: results from a phase I trial. Hepatology international 2023;17(4):850-9

Tan AT, et al. Immunological alterations after immunotherapy with short lived HBV-TCR T cells associates with long-term treatment response in HBV-HCC. Hepatol Commun 2022;6(4):841-54

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