cfDNA甲基化突破性液体活检方法助力头颈癌早期MRD检测

近日，加拿大多伦多大学玛格丽特公主癌症中心D D De Carvalho团队在肿瘤学领域TOP顶刊《ANNALS OF ONCOLOGY》杂志发表题为《Clinical validation of a tissue-agnostic genome-wide methylome enrichment molecular residual disease assay for head and neck malignancies》的科研成果。研究验证了一种基于组织无关（tissue-agnostic）的cfDNA全基因组甲基化富集测序方法（cfMeDIP-seq）检测头颈癌（head and neck cancer, HNC）患者分子残留病（molecular residual disease, MRD）的临床应用价值。研究纳入325名I-IVB期HNC患者，通过纵向收集外周血浆样本，利用cfMeDIP-seq技术检测MRD，并评估其与临床复发的相关性。

标题：Clinical validation of a tissue-agnostic genome-wide methylome enrichment molecular residual disease assay for head and neck malignancies（头颈恶性肿瘤分子残留病灶检测的组织无关全基因组甲基化富集临床验证研究）

发表时间：2024年9月14日

发表平台：ANNALS OF ONCOLOGY（Ann Oncol）

影响因子：IF65.4/Q1

技术平台：cfMeDIP-seq

作者单位：加拿大多伦多大学玛格丽特公主癌症中心D D De Carvalho等

DOI:10.1016/j.annonc.2024.08.2348

对于接受根治性治疗的局部晚期头颈癌（HNC）患者，其治疗效果仍不尽如人意，5年生存率仅为50%。大多数复发发生在治疗后的前两年，这为识别分子残留病（MRD）提供时间窗口。在人乳头瘤病毒（HPV）阳性和阴性HNC患者中，由于组织样本常常稀缺，需要一种与组织无关的MRD检测方法。

本研究纳入包括HPV阳性和阴性的I-IVB期HNC患者，并在诊断时以及根治性治疗后约3、12、24个月纵向收集外周血浆样本。队列包括325名患者，共1155个样本，样本分为不同的集合，用于训练和验证一个能够识别MRD的分类器，该分类器基于一种与组织无关的全基因组甲基化富集平台（cfMeDIP-seq），主要终点是无复发生存率（recurrence-free survival, RFS）。

队列研究结果表明，中位随访时间60个月时，盲法验证集中MRD阳性患者经历显著更差的RFS，风险比（hazard ratio, HR）为35.7。HPV阴性患者HR为42.3，HPV阳性口咽癌患者HR为24.1。MRD阳性与临床复发之间的时间间隔最长可达14.9个月，平均提前时间为4.1个月。监测灵敏度91%，特异性88%。

研究验证了HNC患者MRD检测的cfDNA全基因组甲基化富集检测方法的临床性能特征。该MRD检测方法在不同的解剖部位、HPV状态和治疗方案中，显示出高敏感性和高特异性地鉴定复发能力，突显了其在HNC患者MRD检测中的广泛适用性。

研究方法

• 样本收集：研究纳入325名I-IVB期HNC患者，包括HPV阳性和阴性患者。在诊断时以及治疗后3、12、24个月分别收集外周血浆样本，总共收集了1155个样本。

• cfMeDIP-seq甲基化测序：利用cfMeDIP-seq技术对cfDNA进行甲基化分析。该技术通过免疫沉淀富集甲基化的cfDNA片段，然后进行高通量测序，具有无需化学或酶促转化、非降解、高信号与噪声比等优点。

• 样本处理与分类器开发：将样本分为训练集和验证集。通过训练集开发了一个分类器，用于识别MRD阳性样本，并在验证集中进行验证。分类器通过分析cfDNA甲基化模式来判断MRD状态。

• 统计方法：主要终点是无复发生存率（RFS）。比较MRD检测阳性和阴性患者的RFS，并使用Cox比例风险模型估计风险比（HR）。

结果图形

这是一种与无需依赖组织样本的cfDNA检测方法，用于检测HPV阳性和阴性头颈癌（HNC）患者的分子残留病（MRD），具有非侵入性。临床盲试验表明，通过MRD阳性状态分层的无复发生存率（RFS）存在显著差异。在临床表现或影像学检查之前检测到复发，提前时间最长可达14.9个月（平均4.1个月）。在不同解剖部位、HPV状态和治疗方案中观察到相似的性能，突显了广泛的适用性。

（1）样本收集

研究共纳入325名患者，训练集163人，验证集162人。在可分析数据集（n=149）中，大多数患者年龄在50-69岁之间（66%），白人（71%），男性（77%）。报告吸烟史的患者中，68%为前吸烟者或现吸烟者。早期患者（I-II期）占54%。最常见的解剖亚型为口咽癌（48%）和唇/口腔癌（23%）。口咽癌中HPV阳性率为75%。大多数患者（95%）为鳞状细胞癌。样本因质控失败的总失败率低（0.2%）。

图1：头颈癌患者及其储存的血浆样本。



表1：诊断时的患者人口统计学和临床特征

（2）ctDNA分析

利用非盲训练集（n=163患者），开发了一个分类器，用于检测治疗前样本和治疗后复发样本（MRD阳性）中的ctDNA甲基化信号，与治疗后无复发样本（MRD阴性）进行比较。在外部独立数据集中，这些差异甲基化区域在HNC组织中呈高甲基化状态，与正常组织和健康外周血白细胞相比具有显著差异（P<0.0001），表明分类器能够检测到ctDNA甲基化信号。

图2：cfMeDIP-seq概述

图3：按组织样本类型划分的癌症信号

算法所使用的差异甲基化区域（DMRs）在实体肿瘤组织中的甲基化水平较高，而在外周血淋巴细胞（PBL）和实体正常组织中未发生甲基化。这与该检测方法特异性识别由肿瘤细胞释放的甲基化DNA一致。将DMRs与文献中HNC组织样本的注释进行比较，结果表明该算法对癌细胞甲基化具有特异性。

（3）MRD检测与临床结果的关联

在验证集中，MRD阳性患者的无复发生存率（RFS）显著降低，风险比（HR）为35.7。HPV阴性患者HR为42.3；HPV阳性口咽癌患者HR为24.1。MRD阳性与临床复发之间的时间间隔最长可达14.9个月，平均为4.1个月。



图4：验证集中通过MRD监测检测的事件发生时间的Kaplan-Meier分析。

（A）所有患者（n=124）的无复发生存率（RFS）

（B）所有患者（n=124）的总生存率（OS）

（C）HPV阴性亚组（n=72）

（D）HPV阳性亚组（n=52）

HPV阴性亚组包括HPV阴性的口咽癌（OPC）以及其他头颈癌部位。风险比（HR）后跟括号内的95%置信区间。HPV：人乳头瘤病毒；HR：风险比；MRD：分子残留病；OPC：口咽癌；OS：总生存率；RFS：无复发生存率。

（4）性能

在总体人群中，监测灵敏度为91%（95%CI 77%-97%），特异性为88%（95%CI 80%-93%），阳性预测值（PPV）为74%（95%CI 59%-85%），阴性预测值（NPV）为96%（95%CI 90%-99%）。在不同HPV状态和治疗方案的亚组中，灵敏度和特异性没有显著差异。

表2：按HPV状态和治疗亚组划分的cfMeDIP-seq检测MRD性能

cfMeDIP-seq：游离细胞甲基化DNA免疫沉淀高通量测序；CI：置信区间；CRT：化疗放疗；HNC：头颈癌；HPV：人乳头瘤病毒；MRD：分子残留病；NPV：阴性预测值；OPC：口咽癌；PPV：阳性预测值；RT：放疗。

（5）单变量和多变量分析

单变量分析显示，MRD检测、分期、HPV状态、种族、年龄和吸烟史与RFS显著相关。在多变量分析中，MRD检测结果是预测复发的最强指标（P<0.0001）。在考虑临床因素后，添加MRD检测状态可显著改善复发预测（P<0.0001）。

表3：单变量和多变量Cox比例风险模型

（6）MRD检测评分变化与结果相关

从治疗前（T0）到治疗后（T1-T3）样本的MRD检测评分轨迹显示，未复发患者的MRD检测评分在治疗完成后迅速下降并保持低水平。对于复发患者，许多患者的MRD检测评分在治疗后下降（部分仍高于阈值），但在监测期间大多数复发患者的评分有所增加。例如，复发患者A在治疗前评分较高，手术后下降，复发前增加，所有三个血液样本的评分均高于阈值，MRD在确认复发前364天被检测到。

图5：MRD检测评分的变化与结果相关。

（A）非复发患者和复发患者的MRD检测评分轨迹。红色虚线显示确定样本是否检测到MRD阈值。

（B）代表性案例研究：四名患者的MRD检测。所有四名患者均为鳞状细胞癌。患者A患有III期唇和口腔癌，HPV状态不明。患者B患有III期HPV阳性口咽癌。患者C患有I期HPV阳性口咽癌。患者D患有IVA期唇和口腔癌且无复发。红色虚线显示确定样本是否检测到MRD阈值。星号表示手术日期。阴影矩形区域表示放疗或化疗的时间段。点表示从基线治疗前血液抽取的特定天数的MRD检测评分；红色点表示检测到MRD；蓝色点表示未检测到MRD。X标记复发日期。图中还显示复发的提前时间。

结论和讨论

本研究验证了cfMeDIP-seq技术在HNC患者MRD检测中的临床应用价值。该技术具有高灵敏度和特异性，能够在不同解剖部位、治疗方案和HPV状态的患者中检测MRD，为早期干预提供了可能。cfMeDIP-seq技术的组织无关性和低失败率使其在HNC患者的临床监测中具有广泛的应用前景。未来的研究应进一步探索该技术在其他癌症类型中的应用，并验证其在前瞻性研究中的临床效用。

研究亮点

创新性：该研究提出了一种新的、组织无关的MRD检测方法--cfMeDIP-seq，研究结果表明，该检测方法能够显著改善HNC患者的预后评估和治疗决策，具有重要的临床应用价值。

严谨的研究设计：通过大规模的样本收集、严格的统计分析以及多变量模型的验证，研究结果具有较高的可信度和科学性。

跨学科合作：该研究涉及肿瘤学、生物信息学、分子生物学等多个学科的合作，展示了跨学科研究在解决临床问题中的强大潜力。

参考文献：

Liu G, et al. Clinical validation of a tissue-agnostic genome-wide methylome enrichment molecular residual disease assay for head and neck malignancies. Ann Oncol. 2024 Sep 14.doi: 10.1016/j.annonc.2024.08.2348.