microRNA（miRNA）及其研究应用

miRNA的生物学功能与作用机制

microRNA（miRNA）是一类内源性小RNA分子，与siRNA具有相似的特征。近年来，研究发现miRNA在多种生物过程中发挥重要作用，包括发育、分化和凋亡等。miRNA表达的异常调控与多种癌症及其他疾病密切相关。miRNA系统是基因表达的一种内源性调控机制。成熟的miRNA主要通过转录后抑制机制调控基因表达。此外，miRNA还可通过脱腺苷化和/或脱帽介导mRNA的降解。自然生成的miRNA结合位点通常位于目标mRNA的3'端非编码区（3' UTR）。由于miRNA与靶mRNA的部分互补性，真正的结合位点鉴定往往具有挑战性。

miRNA模拟物与抑制剂的应用

转染miRNA模拟物或抑制剂是研究特定miRNA靶标和功能的有效技术。miRNA模拟物是化学合成的miRNA，模拟自然生成的miRNA在细胞中的功能。miRNA抑制剂是单链修饰RNA，能够特异性抑制miRNA的功能。转染miRNA模拟物后基因表达的减少或转染抑制剂后表达的增加，均表明所研究的miRNA参与了基因调控。此外，通过转染miRNA模拟物或抑制剂并检测特定表型，可以研究miRNA在各种生物学途径中的作用。

miRNA模拟物或抑制剂的转染方法

• 24孔板转染：建议先将细胞铺板，再加入模拟物/抑制剂-试剂复合物，以确保细胞与复合物充分混合。反向转染（先加复合物后加细胞）可根据需要进行。

• 96孔板转染：建议使用反向转染，因其快速便捷，常用于高通量实验。反向转染也是24孔板上miRNA模拟物和抑制剂共转染的优选方法。

质粒DNA与miRNA模拟物/抑制剂的共转染

许多miRNA实验涉及miRNA模拟物和/或抑制剂与质粒DNA载体的共转染。载体中通常包含与miRNA结合位点融合的报告基因（如荧光素酶），用于检测miRNA的调控活性。

优化miRNA转染条件

• 浓度优化：miRNA模拟物或抑制剂的有效浓度因miRNA、细胞系和分析方法而异。建议通过不同浓度的模拟物/抑制剂进行优化实验。miRNA模拟物的最终浓度低至0.5 nM即可抑制目标蛋白表达，但蛋白质水平分析可能需要更高浓度。miRNA抑制剂在50 nM浓度下即可有效抑制miRNA功能，但更低浓度也可能有效。

• 时间优化：miRNA模拟物或抑制剂的效果通常不会立即显现，需通过时程实验确定最佳分析时间。

miRNA实验的对照设置

为正确解释实验结果，设置适当的阳性和阴性对照至关重要。

• miRNA模拟物实验

• 阳性对照：用于验证实验系统的有效性（如模拟物成功转染并下调目标基因）。阳性对照应包含在每个miRNA模拟物实验中，以确保实验条件最优。

• 阴性对照：用于排除非特异性结果。阴性对照结果应与未转染细胞相似，以确认观察结果特异于所研究的miRNA。

• miRNA抑制剂实验

• 阳性对照：通过共转染模拟物和抑制剂，验证抑制剂的有效性。若抑制剂有效，目标基因表达应上调。

• 阴性对照：用于排除非特异性结果。阴性对照结果应与未转染细胞相似。

• 转染对照：为确保高转染效率，需在不同条件下优化转染条件。建议在初始实验中确定最佳转染条件，并在后续实验中作为常规对照。

通过合理设计实验和优化条件，可以有效研究miRNA的功能及其在疾病中的作用。

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