FGF/FGFR2信号通路在肾小管细胞存活及急性肾损伤中作用

1.摘要

本研究旨在探讨成纤维细胞生长因子（FGFs）及其受体FGFR2信号通路在肾小管细胞存活及急性肾损伤（AKI）中的作用及机制。通过肾脏缺血/再灌注（IR）或顺铂注射诱导小鼠AKI模型，并构建肾小管细胞特异性FGFR2基因敲除小鼠模型，结合体外细胞实验，发现FGF/FGFR2信号通过激活Erk1/2通路在防止肾小管细胞死亡和减轻AKI中发挥重要作用。本研究为深入理解FGF/FGFR2信号在肾脏疾病中的作用机制提供了理论依据，并为AKI的治疗提供了潜在的靶点。急性肾损伤（AKI）是一种常见的临床综合征，其特征是肾功能急剧下降，导致代谢废物和液体积聚。AKI的发病机制复杂，涉及多种细胞类型和信号通路的相互作用。肾小管细胞的损伤和死亡是AKI的关键病理生理过程之一。近年来，成纤维细胞生长因子（FGFs）及其受体（FGFRs）在组织修复和细胞存活中的作用受到广泛关注。FGFs是一类肝素结合蛋白，通过与细胞膜上的FGFRs结合激活下游信号通路，参与细胞增殖、分化、存活和迁移等多种生物学过程。其中，FGFR2在多种组织中表达，并在细胞存活和应激反应中发挥重要作用。然而，FGFR2信号在肾小管细胞存活和AKI中的作用尚不清楚。本研究通过构建小鼠模型和体外细胞实验，探讨了FGFR2信号在肾小管细胞存活及AKI中的作用机制。

2. 材料与方法

2.1 实验动物与模型构建

实验使用C57BL/6小鼠，构建肾小管细胞特异性FGFR2基因敲除（KO）小鼠模型。通过Cre-LoxP系统，特异性敲除肾小管细胞中的FGFR2基因。对照组为野生型（WT）同窝仔小鼠。为诱导AKI，部分小鼠接受肾脏缺血/再灌注（IR）处理：在无菌条件下，通过夹闭肾动脉30分钟，随后松开夹子恢复血流；另一部分小鼠通过单剂量腹腔注射顺铂（20 mg/kg）诱导AKI。在不同时间点收集肾脏组织样本，用于后续实验分析。

2.2 细胞培养与处理

培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）。细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于37℃、5% CO₂的培养箱中。为研究FGF2对细胞存活的影响，将细胞分为以下几组：对照组、顺铂处理组（10 μM顺铂）、FGF2处理组（100 ng/ml重组FGF2蛋白）、FGF2+顺铂组以及FGF2+顺铂+PD98059（10 μM）组。PD98059是一种特异性Erk1/2抑制剂，用于阻断Erk1/2信号通路。处理24小时后，收集细胞用于后续实验分析。

2.3 蛋白表达检测

采用Western blot方法检测肾脏组织和细胞中FGFs、Erk1/2及其磷酸化水平等蛋白表达。将组织或细胞样本裂解，提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离后，转膜至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭膜后，分别加入一抗（抗FGFs、抗Erk1/2、抗p-Erk1/2等），4℃孵育过夜。次日，加入相应二抗，室温孵育1小时。最后，采用化学发光法显色，通过凝胶成像系统分析蛋白条带灰度值，以相对灰度值表示蛋白表达水平。

2.4 细胞凋亡检测

采用流式细胞术检测细胞凋亡。收集处理后的NRK-52E细胞，用PBS洗涤后，加入Annexin V-FITC和PI染色液，室温避光孵育15分钟。通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，分析FGF2对顺铂诱导的细胞凋亡的影响。

2.5 数据统计分析

实验数据以均数±标准差（x̄±s）表示，采用SPSS 22.0软件进行统计分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05表示差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1 FGFs和Erk1/2磷酸化在AKI中的变化

在肾脏缺血/再灌注（IR）或顺铂注射诱导的AKI小鼠模型中，肾脏组织中FGFs的表达水平显著升高。Western blot结果显示，与正常对照组相比，IR处理后24小时和顺铂注射后第1天，肾脏中FGFs蛋白表达分别增加了1.8倍和2.0倍（P<0.01）。同时，Erk1/2的磷酸化水平也显著上升。在IR处理后24小时，肾脏中p-Erk1/2与总Erk1/2的比值增加了1.5倍（P<0.05）；顺铂注射后第1天，该比值增加了1.6倍（P<0.01）。这表明在AKI发生过程中，FGFs及其下游信号通路被激活，可能参与了肾脏损伤的应答过程。

3.2 肾小管细胞特异性FGFR2基因敲除对AKI的影响

构建的肾小管细胞特异性FGFR2基因敲除小鼠出生正常，但在2个月大时，约三分之一的基因敲除小鼠出现轻度肾积水。在AKI诱导后，FGFR2基因敲除小鼠的急性肾功能障碍加重。通过检测血清肌酐和尿素氮水平，发现IR处理后24小时，FGFR2基因敲除小鼠的血清肌酐水平较对照组升高了1.4倍（P<0.01），尿素氮水平升高了1.3倍（P<0.05）；顺铂注射后第3天，血清肌酐和尿素氮水平分别较对照组升高了1.5倍（P<0.01）和1.4倍（P<0.01）。此外，FGFR2基因敲除小鼠肾脏中肾小管细胞凋亡显著增加。TUNEL染色结果显示，在IR处理后24小时，FGFR2基因敲除小鼠肾脏中TUNEL阳性细胞数较对照组增加了2.1倍（P<0.01）；顺铂注射后第3天，TUNEL阳性细胞数增加了2.3倍（P<0.01）。这表明肾小管细胞中FGFR2的缺失加重了AKI诱导的肾小管细胞凋亡和肾功能损伤。

3.3 FGF2对肾小管细胞存活的影响及其机制

在体外培养的NRK-52E细胞中，重组FGF2蛋白能够诱导Erk1/2磷酸化。Western blot结果显示，与对照组相比，100 ng/ml FGF2处理细胞后，Erk1/2的磷酸化水平增加了1.7倍（P<0.01）。同时，FGF2能够抑制顺铂诱导的细胞凋亡。流式细胞术检测发现，10 μM顺铂处理细胞后，细胞凋亡率为28.5%±2.3%，而加入100 ng/ml FGF2后，细胞凋亡率降低至16.8%±1.9%（P<0.01）。进一步使用Erk1/2抑制剂PD98059阻断Erk1/2信号通路，发现PD98059能够消除FGF2诱导的Erk1/2磷酸化，并部分逆转FGF2对顺铂诱导的细胞凋亡的保护作用。在FGF2+顺铂+PD98059组中，细胞凋亡率回升至23.4%±2.1%（P<0.05，与FGF2+顺铂组相比）。这表明FGF2通过激活Erk1/2信号通路抑制肾小管细胞凋亡，从而发挥细胞保护作用。

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