类器官原位活死染色实验攻略

概述

在类器官的培养过程中，如果我们想了解类器官的增殖及凋亡状态，可以通过对活细胞和死细胞进行荧光染色，通过荧光显微镜拍照观察。Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光 （Ex=490nm, Em=515nm）。因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯 （AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM （本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM 和CFDA)相比，由于Calcein-AM 细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。 由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧 光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI 仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发，仅可观察到死细胞。

原理本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，以24孔板，每孔25ul类器官基质胶凝聚物为例，每孔添加500μl 染色工作液进行染色。活细胞/死细胞双染试剂盒（abs50056）

实验步骤

一、工作液的配制： 1、1×Assay Buffer（反应缓冲液）的配制 从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水 （dH2O）做10 倍稀释以得到1×Assay Buffer。2、1×染色工作液的配制 （1）先将低温保存的Calcein-AM 溶液(2mM)和PI 溶液（1.5mM）回到室温20-30min。 注意：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。 （2）取5μl Calcein-AM 溶液(2mM)和15μl PI 溶液（1.5mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein-AM 的工作液浓度为2μM，PI 的工作液浓度为4.5 μM。注意：由于不同种类器官的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM 和PI 的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度a 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育类器官1小时，或者用70%乙醇孵育类器官1小时，从而制备死类器官； b 用0.1-10μM 的PI 溶液进行死类器官染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。 c 用0.1-10μM 的Calcein-AM 进行死类器官染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓 度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察活细胞是否能被染色。

二、染色步骤： 以24孔板，每孔25ul类器官基质胶凝聚物为例，检测时，只需弃除类器官培养液，保留孔板内25μl类器官基质胶凝聚物，加入染色工作液即可。1、将类器官培养基吸弃，加入PBS清洗2-3遍，以充分去除残留的酯酶活性，然后弃除PBS。2、 每孔加入500μl 染色工作液，混匀，37℃孵育1小时。3、荧光显微镜下使用490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm 的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。 注意事项1、由于Calcein-AM 对湿度非常敏感，若是Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。2、由于Calcein-AM 的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。3、碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用 自来水清洗。4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

染色效果图展示一、人肝细胞癌类器官明场图

人肝细胞癌类器官扩增过程（由少到多）

二、人肝细胞癌类器官活死染色视频

三、人肝细胞癌类器官活死染色图

人肝细胞癌类器官活细胞、死细胞、活死细胞染色合并图

人肝细胞癌类器官活死细胞染色合并图