靶向胰腺癌KRAS G12V的TCR-T疗法的IND研究

为开发针对KRAS G12V突变的TCR-T过继性T细胞疗法，上海镔铁生物和南京大学医学院附属金陵医院开展了一项用于申报IND的非临床研究，评估一种新的TCR（051）。该TCR来源于一名携带KRAS G12V突变的胰腺导管腺癌（PDAC）患者，该突变可由HLA-A*11:01等位基因呈递，而这一等位基因在中国人群中最为常见。使用健康供体T细胞并转导表达051 TCR的逆转录病毒载体进行了体外实验，以确定该TCR的特异性和功能。肿瘤反应严格依赖于G12V突变和HLA-A*11:01分子的表达。丙氨酸扫描实验未检测到针对人基因组的潜在"脱靶"交叉反应性。目前正在开展GLP的研究，评估过继转移的人源051 TCR-T细胞（IX001）在荷载人胰腺癌异种移植瘤的免疫缺陷小鼠模型中的抗肿瘤疗效、持续性、安全性及毒性。T细胞输注后，无论是否给予IL-2，均观察到显著的抗肿瘤效果。通过逆转录病毒对宿主T细胞中TCR基因整合的分析表明，发生继发性恶性肿瘤的风险较低。未发现与TCR-T相关的毒性或由逆转录病毒载体引起的基因毒性。IX001在胰腺癌CDX模型中表现出良好的安全性和高效的疗效。数据支持进一步开展针对具有G12V KRAS突变的HLA-A*11:01患者的IX001临床研究。

癌细胞通常会发生体细胞突变，从而启动并维持肿瘤的生长和发展。数十年来的研究证据表明，内源性T细胞介导的抗肿瘤反应可以靶向这些体细胞突变产生的新抗原。突变频率最高的基因是KRAS，在所有癌症中占比达14%。在PDAC中，KRAS的突变率高达88%，是全球癌症死亡的第三大原因，五年生存率仅为8-12%。KRAS编码一种小GTP酶，可在与GDP结合的非活性形式和与GTP结合的活性形式之间转换。KRAS介导调控细胞存活、生长和分化的信号传导通路。KRAS的一个高频点突变发生在G12，其中最常见的两种突变是G12D和G12V，分别占胰腺癌中KRAS突变的37%和29%。

缺乏针对小分子的突变特异性结合口袋使靶向药物的开发变得复杂。KRAS曾被视为"不可成药的靶点"。尽管针对肺癌和结直肠癌患者中KRAS G12C突变的小分子抑制剂已成功开发并获得FDA批准，但由于G12C突变在胰腺癌患者中极为罕见（不到1%），其影响可能有限。值得注意的是，目前已有几种针对G12D或泛G12X的小分子抑制剂正在进行临床试验。胰腺癌患者是否能从这些研究中获益仍有待观察。

KRAS是一种细胞内蛋白，无法被抗体治疗或CAR-T细胞疗法靶向。然而，突变型KRAS产生的免疫肽可以由HLA呈递，并被T细胞识别为新抗原。近年来，靶向突变KRAS的过继T细胞疗法作为一种新的肿瘤控制策略逐渐受到关注。例如，Rosenberg及其同事的研究人员鉴定出一种能够靶向KRAS G12D突变的T细胞克隆，并在HLA-C*08:02背景下开发了基于T细胞的治疗方案。然而，由于HLA-C*08:02在人群中的频率较低，限制了其广泛应用。因此，目前正在进行努力开发针对更常见HLA类型患者的过继TCR-T疗法。此后，研究人员已在多种HLA背景下鉴定了靶向不同KRAS突变的TCRs。此外，还有一种识别KRAS G12V表位的鼠源TCR克隆从HLA-A*11:01转基因小鼠中分离出来，以及一种在HLA-A*11:01和HLA-A*03:01背景下靶向KRAS G12V肽段的TCRm抗体。然而，这些经过工程改造的TCRm特异性仍不够明确，且可能存在不可预测的脱靶反应性。

这里采用优化的体外致敏（IVS）方案，利用表达TMG的自体T细胞，从PDAC患者中分离出特异性针对KRAS G12V突变的TIL。随后通过流式细胞术标记并筛选出能够结合HLA-A*11:01/G12V四聚体的反应性TIL。通过对单细胞TCR序列的分析，鉴定了排名Top10的TCR克隆的α链和β链，并进行了合成。将这些TCR克隆至逆转录病毒载体中，并用于转导原代T细胞以制备TCR-T细胞。对构建的051 TCR-T细胞进行了评估，包括其对突变型KRAS表位的特异性、抗肿瘤效果以及安全性，为在中国开展治疗胰腺癌的临床试验提交了IND申请。

051 TCR载体构建以及临床前级和GMP级051逆转录病毒的制备

为避免与内源性TCR错配并保留051 TCR的功能，在优化的MSGV衍生杂交载体中，将原有TCR恒定区替换为改良的小鼠TCR恒定α链（Cα）和β链（Cβ），构建了051 TCR逆转录病毒载体。构建了单一顺反子逆转录病毒载体，并比较了两种不同结构：一种是Vα-Cα插入P2A后连接Vβ-Cβ（α+β）；另一种是Vβ-Cβ插入P2A后连接Vα-Cα（β+α）。将这两种不同构建体的逆转录病毒感染原代人T细胞后，使用抗小鼠TCRβ抗体通过流式细胞术检测小鼠TCR Cβ的表达水平以评估051 TCR的表达情况。由于β+α结构显示出更高的TCR表面表达水平，因此选择该结构用于后续实验。

为确保所有临床前研究和产品生产工艺优化所需的足量051 TCR逆转录病毒载体供应，采用了一株稳定的051 TCR逆转录病毒载体生产细胞系（HEK293-P037-clone46）。该自研的人源293细胞衍生的逆转录病毒包装细胞系能够高效产生携带RD114包膜蛋白的复制缺陷型051 TCR γ-逆转录病毒颗粒。尽管该逆转录病毒载体已被设计为复制缺陷型，在临床前使用前仍始终保持警惕，对病毒进行了筛查，以防止患者可能接触到具有复制能力的逆转录病毒（RCR）。符合GMP标准的逆转录病毒生产批次通过了所有放行检测指标，包括外观、pH值、渗透压、物理病毒载体滴度、感染性滴度、残留E1A、残留宿主细胞蛋白、残留苯甲酸酶、支原体污染、无菌性、内毒素水平以及复制型逆转录病毒（RCR）检测。

051 TCR-T细胞的体外生成与表征

为细胞制备建立了可接受标准，涵盖了一系列全面的参数以确保产品质量与安全性。这些标准包括外观、pH值、渗透压、细胞活力、活细胞密度、活细胞数量、活mTCR+细胞数量、细胞表型、转导效率、CD3+ T细胞比例、细胞功能、细胞类型、残留小鼠IgG、残留RetroNectin、支原体污染、无菌性、内毒素水平、RCR检测以及载体拷贝数（VCN）。所制备的TCR-T细胞经过检测，符合所有批次放行标准。

051 TCR-T细胞特异性评估

通过使用HLA-A*11:01/G12V四聚体复合物染色评估TCR-T细胞对KRAS G12V肽的反应性。051 TCR-T细胞可被负载KRAS G12V 10肽的HLA-A*11:01四聚体染色，但不能被KRAS G12V 9肽的四聚体染色。此外，携带9肽WT肽或10肽WT肽的四聚体复合物均未染色051 TCR-T细胞。作为对照，在实验中还加入了一个阳性对照TCR（PCV-TCR），其可在HLA-A*11:01分子背景下特异性识别KRAS G12V 9肽，该TCR可被KRAS G12V 9肽的四聚体染色，但不能被10肽染色。这些结果表明，表达051 TCR的T细胞特异性识别突变型KRAS G12V 10肽表位，而不识别9肽突变肽或WT肽。

除了MHC四聚体染色外，还通过检测不同肽刺激后T细胞活化标志物4-1BB分子的上调情况，评估了051 TCR的特异性和活化能力。发现只有KRAS G12V 10肽，而G12C、G12D、G12R、G12V 9肽或WT 9肽/10肽均不能诱导T细胞活化（图1A）。KRAS肽的滴定结果显示，G12V 10肽以剂量依赖方式特异性激活TCR-T细胞（EC50=0.18nM）（图1B）。在平行实验中，仅用G12V 10肽脉冲的淋巴母细胞可引发类似的剂量依赖性TCR-T细胞活化。相比之下，G12V 9肽和WT 10肽/9肽均未引发此类活化。G12V 9肽仅在1 µM的高剂量下表现出微弱的激活作用。

图1 TCR-T的特异性和激活。

051 TCR-T细胞的抗原特异性增殖

为了评估051 TCR-T细胞在肿瘤细胞刺激下的增殖能力，在体外将TCR-T细胞与癌细胞共培养，并通过流式细胞术分析T细胞的增殖情况。只有当癌细胞携带KRAS G12V突变（PANC1-TMG）时，才观察到TCR-T细胞的增殖。在使用PANC-1肿瘤细胞（G12D突变）或未转导的NT细胞刺激时，未检测到051 TCR-T细胞的增殖（图1C）。这表明经过改造的TCR-T细胞能够特异性识别并响应KRAS G12V突变，从而引发其增殖。这种特异性对于靶向抗肿瘤反应至关重要，因为它确保了TCR-T细胞仅在存在携带特定KRAS G12V突变的癌细胞时才会选择性扩增并发挥细胞毒性作用。这种选择性增殖进一步凸显了051 TCR-T细胞在靶向KRAS G12V突变肿瘤中的潜在疗效。

051 TCR-T细胞亲和力评估

通常，CAR分子表现出nM级的亲和力，而TCR分子一般具有μM级的亲和力。TCR的激活需要与抗原及HLA分子相互作用，并涉及共受体及其他对于形成免疫突触至关重要的细胞表面分子。此外，这些分子的构象变化在此过程中起着关键作用。由于上述复杂性，采用z-Movi技术检测了TCR-T细胞与肿瘤细胞的相互作用，定义为细胞结合的结合力。图1D显示，在与HepG2肝癌细胞结合时，GPC3 CAR-T细胞的结合力（1000pN下为1.68）高于AFP TCR-T细胞（1000pN下为1.18）。由于TCR-T细胞相较CAR-T细胞具有相对较低的结合力，因此添加了一种额外的抗原（KRAS G12V 10肽）以增强信号，从而区分不同TCR之间的差异。图1E展示了两批051 TCR-T细胞的相对结合力（#1：1000pN下为1.75；#2：1000pN下为1.63），均高于此前Rosenberg团队分离的PCV G12V特异性TCR-T细胞（1000pN下为1.48）。TCR对天然肿瘤细胞的细胞结合力过低以至于无法检测；只有在加入外源肽后才能测量到结合力。与CAR-T细胞不同，该技术无法测量TCR-T细胞真实的细胞结合力。

051 TCR-T细胞的抗原特异性细胞毒性和细胞因子释放

接下来，在体外检测了T细胞对胰腺癌细胞系的激活和细胞毒性。通过将靶向癌细胞转染以表达荧光素酶，并在与TCR-T细胞共培养后检测荧光素酶水平的降低来衡量细胞裂解情况。与上述结果一致，表达051 TCR的人T细胞对携带KRAS G12V突变且HLA-A*11:01阳性的癌细胞表现出特异性裂解活性。由于目前尚无同时内源性表达HLA-A*11:01和KRAS G12V突变的细胞系，因此对靶向癌细胞系进行了改造，以确保其同时表达HLA-A*11:01和KRAS G12V突变。

通过逆转录病毒转导，将KRAS G12V抗原导入了本身呈HLA-A*11:01阳性的胰腺癌细胞PANC1（PANC1-TMG细胞）。在结肠癌细胞SW620（SW620-A*11:01细胞）、肺癌细胞COR-L23（COR-L23-A11细胞）以及胰腺癌细胞CFPAC1（CFPAC1-A11细胞）中过表达了HLA-A*11:01，这些细胞均携带KRAS G12V突变。将效应（E）TCR-T细胞与每种靶向癌细胞系（T）共培养后，发现051 TCR-T细胞能够引发针对PANC1-TMG、SW620-A11和COR-L23-A11的、受HLA-A*11:01限制的细胞激活和细胞毒性作用，但对缺乏KRAS G12V抗原或HLA-A*11:01的癌细胞则无此作用（图2）。在表达G12V的PANC1细胞中观察到了剂量依赖性的细胞毒性（图2A）。为了确定051 TCRβ链CDR3区的关键残基（CASSEGQYSYEQYF），对其中的GQYSY序列进行了丙氨酸扫描。发现，CASSEGAASYEQYF突变无法被TCR识别（冷TCR）。051 TCRβ链CDR3区的突变损害了其与抗原的结合能力，导致细胞溶解活性显著减弱（冷TCR-T细胞）。同样地，当KRAS G12V抗原不表达（PANC1细胞）或通过B2M敲除使表面HLA分子下调（PANC1-B2MKO细胞）时，细胞溶解活性也完全消失（图2A）。

细胞因子谱显示，当将PANC1-TMG细胞加入培养体系中时，IL-2、IL-4、TNF-α和IFN-γ的释放呈现剂量依赖性（图2B）。TCR-T细胞在杀伤PANC1-TMG细胞过程中分泌的IL-6和IL-10水平，与和PANC1或PANC1-B2MKO细胞共培养时观察到的水平没有显著差异（图2B）。这些结果表明，051 TCR-T细胞对PANC1细胞的杀伤作用以及细胞因子的释放依赖于TCR、KRAS G12V抗原和HLA-A*11:01。

除了已建立的肿瘤细胞系外，还评估了IX001 T细胞对自体肿瘤碎片和具有匹配HLA-A*11:01的异体肿瘤碎片的反应能力。将新鲜冷冻的肿瘤碎片（NJ051和NJ054）解冻后与IX001 T细胞共培养。未转导（NT）T细胞作为阴性对照。通过流式细胞术分析检测4-1BB表面标志物的上调情况。结果显示，无论是自体还是异体的肿瘤碎片均能够激活IX001 T细胞；而在NT T细胞中则未观察到T细胞活化。

图2 051 TCR-T细胞的细胞毒性和细胞因子谱。

051 TCR-T细胞无脱靶毒性，且对常见HLA的异体反应概率较低

TCR能够识别特定的肽-MHC复合物，但同时人们也认识到，单个TCR可能与具有相似MHC结合基序的多种肽发生交叉反应，从而引发交叉反应性并带来潜在的脱靶毒性。分子模拟可能导致TCR结合正常细胞呈递的肽，诱发类似自身免疫的反应并对健康组织造成损伤。为了评估051 TCR-T细胞是否存在脱靶毒性的可能性，研究人员对KRAS G12V 10肽进行了丙氨酸扫描实验，以鉴定可能的交叉反应性肽段。实验中使用丙氨酸依次替换KRAS G12V 10肽中的每个氨基酸，共合成出10种新的肽，并用于刺激051 TCR-T细胞（表1）。值得注意的是，Ala11被甘氨酸取代。结果显示，以下丙氨酸替换的肽会降低051 TCR-T细胞的激活水平：VVVAAGGVGK、VVVGAAGVGK、VVVGAGAVGK、VVVGAGGAGK、VVVGAGGVAK和VVVGAGGVGA（加粗的"A"表示被丙氨酸取代的氨基酸）。实验结果还显示，替换下划线标注的氨基酸（VVVGAVGVGK）完全消除了TCR-T细胞的激活，表明该位点在TCR识别和激活中起关键作用（图3A）。随后，将包含这些关键氨基酸的肽基序（XXXGXVGVGK）在人类蛋白质组中进行比对，发现了6种可由正常人体细胞呈递的天然肽（pep70-pep75）（表1）。当使用这6种天然肽刺激051 TCR-T细胞时，均未引发任何激活信号。因此，051 TCR-T细胞识别自身抗原的可能性较低（图3B）。结合051 TCR-T细胞无法识别野生型KRAS以及其他G12突变体（G12D、G12R和G12S）的特性，其脱靶毒性风险预计非常低。

TCR-T治疗的另一个安全问题是当使用从不同患者分离的TCR时，TCR-T细胞可能对HLA产生异体反应。利用不表达HLA I类分子的K562细胞表达多种HLA等位基因，以评估在不存在G12V突变的情况下可能的反应性。所有转染了HLA基因的K562细胞均未能激活051 TCR-T细胞；而表达HLA-A*11:01的K562细胞在负载KRAS G12V 10肽后则可有效刺激051 TCR-T细胞。这些结果表明051 TCR-T细胞几乎不会与其他HLA等位基因发生反应，仅识别HLA-A*11:01，说明其异体反应的风险较低。

表1 所有肽段的氨基酸序列均显示如下

图3 丙氨酸扫描实验。

051 TCR-T细胞的体内疗效

使用GMP级的编码051 TCR的逆转录病毒，利用来自三位健康供体的血细胞分离产品优化了TCR-T细胞的制备工艺（图4A）。随后，在GLP规范下，采用皮下接种PANC1-TMG肿瘤的免疫缺陷NPG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst）评估051 TCR-T细胞在体内的抗肿瘤效果（图4B）。实验中，小鼠接受单次输注低剂量（3×10^6个细胞）或高剂量（10×10^6个细胞）的TCR-T细胞，并在3天内每隔12h进行6次皮下注射IL-2（20,000 IU）。在T细胞输注后第7天开始观察到抗肿瘤作用，自第15天起实现无瘤状态（图4C）。未接受细胞输注（对照液或IL-2）、未转导T细胞（NT+IL-2）或仅接受IL-2治疗的小鼠中，抗肿瘤作用微乎其微（图4C）。治疗显示出良好的安全性，因为治疗后小鼠的体重与未治疗组相比无明显差异（图4D）。在观察结束时（第72天），接受低剂量和高剂量TCR-T细胞注射的小鼠存活率均为100%（图4E）。相比之下，单独IL-2组的存活率为50%，NT联合IL-2组为38%，对照液组仅为13%（图4E）。这表明051 TCR-T细胞能够有效治疗已建立异种移植瘤的小鼠。

图4 过继转移051 TCR-T细胞在体内发挥的抗肿瘤功能。

051 TCR-T细胞在肿瘤中的选择性富集

为了解051 TCR在体内卓越的抗肿瘤活性，通过RT-PCR分析评估了输注T细胞的组织分布。如图5所示，在静脉注射051 TCR-T细胞后，T细胞在2小时内首先到达肺部，在其他部位几乎检测不到。药代动力学结果显示，051 TCR-T细胞从第7天起开始浸润、扩增并在肿瘤中持续存在（图5）。TCR-T细胞在肿瘤内部的扩增高峰出现在第8天至第15天之间（图5）。此时，注射的TCR-T细胞在包括睾丸、脑、脊髓、十二指肠、胰腺和卵巢在内的正常器官中几乎无法检测到。仅在肾上腺、胃、肾、肝、心脏、子宫以及附睾中检测到少量TCR-T细胞。这些结果表明，注射的051 TCR-T细胞能够特异性迁移并浸润到肿瘤组织，并在其中进一步被激活和扩增。这种特异性的归巢能力和扩增能力被认为在所有治疗小鼠的肿瘤完全消退中发挥了关键作用。

图5 过继转移至荷瘤小鼠后051 TCR-T细胞的组织分布。

GLP毒理学研究显示051 TCR-T细胞无相关毒性反应

接下来，采用相同的携带PANC1-TMG肿瘤异种移植的NPG小鼠模型评估TCR-T细胞在体内的安全性。重要的是，发现高剂量组（10×10^6个TCR-T细胞）和低剂量组（3×10^6个TCR-T细胞）的抗肿瘤效果相当，这表明TCR-T细胞治疗具有良好的疗效保证。这种效果在对照组、NT对照组或仅给予IL-2的组中均未观察到。雄性和雌性小鼠在接受TCR-T细胞输注后的反应相似。小鼠体重变化无统计学差异。在每组各40只小鼠中，NT对照组（1/40）、3×10^6 TCR-T + IL2组（1/40）和10×10^6 TCR-T组（1/40）各有1只小鼠死亡，而IL-2对照组有2只小鼠死亡（2/40）。由于未观察到与死亡相关的组织病理学改变，且同组中大多数小鼠存活，推测死亡原因可能为肿瘤负荷，而非TCR-T细胞输注所致。

人IFN-γ水平是抗肿瘤效果的关键指标，在所有组别中，无论雄性还是雌性荷瘤小鼠，接受10×10^6个TCR-T细胞治疗并皮下注射低剂量IL-2的小鼠血液中IFN-γ水平最高。在无瘤小鼠或仅接受10×10^6个TCR-T细胞治疗而未给予IL-2的荷瘤小鼠，以及接受3×10⁶个TCR-T细胞加IL-2治疗的荷瘤小鼠中，细胞因子水平较低。药代动力学研究显示，在注射IL-2三天后（第4天）的IFN-γ水平明显高于观察期末（第29天），这与在这些时间点检测到的小鼠体内CD3+CD8+mTCR+淋巴细胞数量一致。这表明IL-2的给予可以增加TCR-T细胞分泌IFN-γ，且分泌水平与TCR-T细胞数量相关。其他人细胞因子（如IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α）检测水平较低，不同组别之间未见明显差异。低水平的IL-6和TNF-α与接受051-TCR-T细胞的小鼠未出现CRS和明显毒性一致。

器官重量的变化。接受10×10^6 TCR-T细胞和IL-2治疗的雄性小鼠，其心脏、肝脏、脾脏和肾脏重量显著增加（P≤0.05）。接受3×10^6个TCR-T细胞和IL-2治疗的雄性小鼠，其肝脏和肾脏重量增加的幅度较小（P≤0.05）。在接受3×10^6 TCR-T细胞或IL-2以及10×10^6 TCR-T细胞和IL-2治疗的雌性小鼠中，肝脏、肾脏、卵巢和子宫的重量增加明显较小（P≤0.05）。未输注IL-2的情况下，仅接受10×10^6个TCR-T细胞治疗的小鼠在器官重量增加方面没有统计学上的显著差异。因此，051 TCR-T细胞输注具有高度有效性，并可在无明显毒性的情况下安全使用。然而，即使在本研究所使用的低剂量下，IL-2的给药仍可能具有毒性。

在给药后第3天（第4天）和观察期结束时（第29天）进行了组织病理学检查。第4天，与对照组相比，在接受10×10^6个TCR-T细胞治疗的小鼠，以及接受3×10^6或10×10^6个TCR-T细胞加IL-2治疗的小鼠中，均观察到轻度至中度的中性粒细胞浸润。这种浸润与受试物的抗肿瘤作用有关。在观察期结束时（第29天），与对照组相比，接受NT细胞治疗的小鼠在肺部、下颌下腺、输卵管、移植瘤和胸腺中出现轻度至极轻度的单核细胞浸润，与NT细胞相关。接受10×10^6个TCR-T细胞治疗的小鼠在肺部、胸腺、下颌下腺和肿瘤接种部位有轻度单核细胞浸润，与TCR-T细胞相关。接受3×10^6个TCR-T细胞加IL-2治疗的小鼠在肺部、胸腺、输卵管和移植瘤接种部位出现轻度单核细胞浸润，与TCR-T细胞输注有关。接受10×10^6个TCR-T细胞加IL-2治疗的小鼠在脾脏、胸腺、移植瘤接种部位、肺部和下颌下淋巴结中出现轻度至中度的单核细胞浸润，与TCR-T细胞相关。接受IL-2治疗的小鼠未见与IL-2注射相关的组织病理学改变。因此，在多个组织和器官中观察到不同程度的单核细胞浸润，主要与由NT或TCR-T细胞引起的GVHD相关。IL-2组的浸润程度略高，但均未被认定为明显的不良反应。

血液生化指标。与对照组相比，在第4天，接受10×10^6个TCR-T细胞治疗的雄性小鼠ALB水平出现明显下降，差异具有统计学意义（P≤0.05），但下降幅度相对较小（变化率为12.46%），被认为属于实验中的正常波动，无毒理学意义。在观察期结束时（第29天），接受3×10^6或10×10^6个TCR-T细胞加IL-2治疗的雄性小鼠ALT水平显著升高；而雌性小鼠的ALP水平显著升高，TC则下降。接受10×10^6个TCR-T细胞治疗的雌性小鼠ALP水平也升高。这些变化与TCR-T细胞和/或IL-2给药后的免疫调节作用有关。此外，其余各组雌性和雄性小鼠的血液生化参数均未发现明显异常，差异无统计学意义（P>0.05）。

兔皮试验和软琼脂克隆形成试验

采用兔耳皮肤反应研究来评估TCR-T细胞的体内毒性。当TCR-T细胞通过兔耳静脉注射后，未观察到与TCR-T相关的刺激反应。此外，还进行了软琼脂克隆形成试验，以评估转导T细胞发生转化的可能性。试验中使用了正常细胞MRC-5，这是一种二倍体胎儿肺细胞系，作为阴性对照。根据世界卫生组织文件，能够在软琼脂中非贴壁依赖性生长的HeLa细胞被认为具有致瘤性，并被用作阳性对照。如预期所示，阳性对照HeLa细胞在三周的培养过程中克隆形成数量逐渐增加。相比之下，将TCR-T细胞以不同密度（1×10^3 TCR-T/孔、2×10^3 TCR-T/孔、4×10^3 TCR-T/孔）接种于软琼脂中，或接种MRC-5阴性对照细胞，均未观察到任何克隆形成。这些结果一致表明转导的051-TCR T细胞无致热原性且不具致瘤性。

TCR基因整合位点分析

为了解决由于逆转录病毒基因随机整合到致癌位点而引起的T细胞转化担忧，分析了TCR转基因在逆转录病毒载体的人基因组中的整合位点。总共从三个TCR-T样本（样本编号A039010001D01、A039010002D01、A039010003D01）的272530次整合事件中识别出2029个独特的整合位点（UIS）。其中仅有87个UIS（4.29%）位于癌症相关基因中（定义为转录起始位点（TSS）上游100kb至基因下游区域）。在样本A039010001D01中观察到携带MPHOSPH9基因整合位点的TCR-T克隆具有最高的UIS比例，占克隆贡献的9.32%（表2）。此外，在样本A039010001D01中，携带癌症相关基因MSI2整合位点的TCR-T克隆具有最高的克隆贡献，达到1.60%（图6A）。这些克隆贡献远低于欧洲药品管理局（EMA）为基因治疗产品设定的30%阈值。

图6B显示了前10个常见整合位点（CISs），其中在50kb范围内相邻的整合位点被定义为CISs。前10个UISs（表2）或癌症相关基因中的UISs（图6A）均未出现在前10个CISs中。

还分析了整合位点位置的分布模式。整合位点在Y染色体上较少见，且在其他染色体上的分布没有明显差异（图6C-a）。它们更倾向于出现在内含子中，而非外显子（图6C-b），并且集中在转录起始位点（TSS）上游5 kb范围内（图6C-c）。这些结果表明逆转录病毒整合后形成优势克隆的风险较低。

表2 前10位独特的整合位点（UIS）

图6 IX001细胞产品的整合位点（IS）分析。

总结

这里，进行了临床前研究以评估一种新型TCR-T疗法治疗晚期胰腺癌的安全性和可行性。本研究所用TCR的Vα和Vβ序列来源于一名晚期胰腺癌患者来源的051 TCR（专利CN117264043B）。验证了转导了051 TCR的T细胞在体外和体内的抗肿瘤作用。GLP毒性研究显示，T细胞具有良好的安全性，未观察到与T细胞输注相关的明显毒性反应。

FDA近期提出的另一个安全问题是，由病毒载体介导的转基因整合可能引发继发性恶性肿瘤。近期，FDA针对接受商业化CAR-T产品治疗后出现T细胞恶性肿瘤的情况发布了黑框警告，因为已在恶性克隆中检测到CAR转基因的存在。然而，携带插入的CAR转基因的继发性恶性肿瘤患者比例较低，且因果关系尚未完全明确。一种被提出的作用机制是，病毒将转基因整合入宿主基因组，导致某些细胞克隆的存活能力或生长速度提高，从而引发不可预料且无法控制的克隆扩增，进而可能形成继发性恶性肿瘤。在这里，无论是在正常基因还是癌症相关基因中，含有UIS的克隆在每个TCR-T样本中所占比例都很小，并且低于EMA规定的主导克隆预警阈值。已有文献记载的与恶性肿瘤相关的基因包括LMO2、MN1、MDS/EVI1、CCND2等，而在生产的细胞产品中从未检测到任何UIS。

根据上述分析，得出结论：051 TCR-T细胞对携带KRAS G12V（10mer）表位和HLA-A*11:01分子的癌细胞具有高度特异性。通过逆转录病毒载体转导改造的051 TCR-T细胞与脱靶毒性或继发性恶性肿瘤的风险较低相关。在临床前胰腺癌异种移植模型中，输注051 TCR-T细胞表现出显著的有效性和良好的安全性。本文所述的研究结果用于支持一个新的IND申请，并已提交至CDE审批。2024年10月9日，051 TCR-T细胞已获CDE批准开展临床试验，命名为"IX001 TCR-T"（受理号：CXSL2400445 & CXSL2400446）。2025年3月27日，"IX001 TCR-T注射液"的I期临床研究正式启动。

需要注意的是，尽管IX001 TCR-T已在中国获得CDE的批准，但不同国家的监管机构可能要求开展不同的实验。此处呈现的结果不应被视为TCR-T细胞治疗IND申报的通用指南。此外，目前可用于预测人体潜在毒性的体外和体内模型仍然有限。需要强调的是，这里之所以开展这些研究，是因为监管机构的要求，但它们在预测TCR-T细胞治疗相关毒性方面的作用仍存在局限性。在细胞药物研发和临床试验过程中，应始终关注急性毒性的监测。

Wang S, et al. Expansion of KRAS hotspot mutations reactive T cells from human pancreatic tumors using autologous T cells as the antigen-presenting cells. Cancer Immunol Immunother. 2023 May;72(5):1301-1313.

Wang S, et al. IND-Enabling Studies for a TCR-T targeting a pancreatic cancer G12V KRAS mutation. Clin Cancer Res. 2025 Jun 30.

CN117264043B-靶向KRAS G12V突变多肽的T细胞受体及其用途