LAG-3与TCR的空间接近介导对T细胞和自身免疫反应的抑制

在自身免疫疾病中治疗性靶向致病性T细胞一直是一项挑战。尽管LAG-3是一种仅在活化T细胞上特异性表达的抑制性检查点受体，并已知能够结合MHC II类分子。这里，纽约大学格罗斯曼医学院王俊教授团队，联合中国科学院生物物理研究所娄继忠研究员团队、浙江大学医学院陈伟教授团队发现，仅与MHC II类分子结合不足以实现LAG-3的最佳功能，相反，LAG-3必须在空间上靠近TCR，而非CD4共受体，而这一接近性由相应的肽段-MHC II类分子复合物所促成，对于介导CD4+ T细胞的抑制至关重要。从机制上看，LAG-3通过其胞内区域的FSAL结构域与TCR信号成分CD3ε形成凝聚物，从而破坏了CD3ε与Lck之间的结合。为了利用LAG-3与TCR之间的接近性并最大化依赖LAG-3的T细胞抑制作用，这里开发了一种Fc段减弱的LAG-3/TCR抑制性双特异性抗体，以绕过对相应肽段-MHC II类分子复合物的需求。这种方法能够有效抑制CD4+和CD8+ T细胞，并在小鼠模型中显著缓解自身免疫症状。研究揭示了一种复杂且具有条件性的检查点调控机制，并强调了针对LAG-3与TCR顺式邻近关系在缺乏有效且耐受性良好免疫疗法的T细胞驱动型自身免疫疾病中的潜力。

自身免疫性疾病源于过度活跃的免疫反应导致的组织损伤。尽管现有疗法通常以细胞因子为靶点或通过清除B细胞进行治疗，T细胞也在诸如1型糖尿病、肝炎、多发性硬化症和类风湿关节炎（RA）等多种疾病中发挥核心作用。T细胞可通过直接的细胞毒作用、释放细胞因子以及借助辅助性T细胞调控其他免疫细胞来参与疾病的发生发展。然而，广泛的T细胞抑制可能带来免疫缺陷、癌症及机会性感染的风险，这在使用糖皮质激素或JAK抑制剂时尤为明显。目前尚未满足的关键需求是一种能够选择性靶向自身反应性或致病性T细胞、同时保留有益T细胞功能的治疗方法。

T细胞激活始于APCs上的pMHC I类或pMHC II类复合物与TCR复合物结合，该复合物由TCRα/β和CD3链组成。这会引发细胞内基于ITAMs的磷酸化，招募Lck和Zap-70，从而放大信号传导。CD4或CD8共受体分别将TCR桥接至MHC II类或MHC I类分子，有助于招募Lck。最近的研究表明，Lck还可以通过相分离/凝聚作用与CD3ε形成TCR信号体以实现活跃的信号传导。靶向CD3ε的抗体Teplizumab已被批准用于延缓1型糖尿病的发病，但长期使用受到安全性问题的限制。除了TCR信号传导之外，T细胞的激活还受到共刺激（如CD28）和共抑制（如CTLA-4、PD-1和LAG-3，统称为免疫检查点）通路的影响。阻断CD28介导的T细胞启动的CTLA-4诱饵蛋白仅限于某些自身免疫性疾病（如类风湿关节炎）中使用，而增强抗肿瘤免疫的免疫检查点阻断疗法已重塑癌症治疗。然而，免疫检查点阻断疗法以及检查点基因的突变通常与自身免疫有关。在这方面，正在探索专门靶向活化T细胞的检查点激动剂。PD-1激动剂在自身免疫性疾病（如类风湿关节炎等）中初步展现出潜力，但这很大程度依赖于FcR的参与，导致T细胞的抑制和/或清除。这种复杂的作用机制，以及PD-1配体广泛表达可能使PD-1抑制信号饱和，或许可以解释当前临床试验中PD-1激动剂疗效有限的原因。

LAG-3是一种抑制性受体，在初始T细胞上表达极少，但在激活后显著上调。与PD-1类似，它也是癌症和慢性感染中耗竭T细胞的标志。与其他检查点受体相比，LAG-3在多种自身免疫性疾病中的致病性T细胞上更为富集。作为CD4的同源物，LAG-3结合MHC II分子，特别是稳定的pMHC II类复合物，但却对CD4+ T细胞起到抑制作用。尽管MHC II/LAG-3在CD4+ T细胞上的作用机制较为明确，但LAG-3也对CD8+ T细胞具有抑制效应，这激发了对其他可能的LAG-3配体的研究，如LSECtin和半乳糖凝集素-3。FGL1，一种通常由肝脏分泌、但在癌细胞中可被诱导产生的蛋白，是LAG-3的功能性配体。FGL1能够促进LAG-3的聚集，而FGL1/LAG-3轴已在癌症和自身免疫中被发现发挥作用。进一步发现，LAG-3通过其胞外D2发生二聚化，从而别构调控其通过D1结构域与MHC II和FGL1的结合，进而调节其抑制功能。不同于与TCR或CD4竞争结合的观点，LAG-3被认为通过其胞内结构域（ICD）传递信号，该结构域缺乏基于ITIMs，但包含FSAL、KIEELE以及一个EP重复基序。与PD-1和其他检查点受体类似，LAG-3也被观察到存在于免疫突触中，并且与TCR-CD3复合物密切相关，但其机制基础尚不明确。此前认为酸性的EP重复序列可在无MHC II存在的情况下降低免疫突触局部的pH值，干扰Lck与CD4或CD8共受体的结合。然而，FSAL基序被发现对于MHC II/LAG-3介导的T细胞抑制，特别是在CD4+ T细胞上的作用至关重要。

尽管许多LAG-3拮抗剂正在癌症临床试验中进行评估，例如最近获批的relatlimab可同时阻断MHC II类和FGL1配体，但靶向LAG-3在自身免疫中的潜力仍有待深入探索。与PD-1不同，PD-1的抑制功能由配体直接结合触发，而这里研究发现表明，MHC II/LAG-3通路需要TCR空间上的接近才能有效抑制CD4⁺ T细胞。进一步解析了其作用机制，发现LAG-3通过改变CD3ε与Lck的结合来干扰早期TCR信号传导。LAG-3配体-受体生物学特性的条件性和复杂性可能解释了LAG-3阻断疗法在癌症中疗效有限的原因，同时也为增强LAG-3依赖的自身免疫抑制提供了潜在机会。为了利用LAG-3的TCR抑制机制，开发了一种双特异性抗体，该抗体采用一种LAG-3结合分子与一种单价TCR部分抑制剂配对的方式，强制实现LAG-3与TCR的空间接近。这种基于空间调控的方法能够强效且抗原特异性地抑制小鼠CD8+和CD4+ T细胞反应，并在自身免疫模型中有效缓解疾病症状。

LAG-3在存在同源pMHC II类分子的情况下介导对CD4+ T细胞的抑制

LAG-3在T细胞抑制中的作用已在涉及同源pMHC II/TCR相互作用以及多种其他免疫配体-受体对（例如B7-1/CD28）的B细胞与CD4 + T细胞共培养系统中进行了广泛研究（图1A）。在这些系统中，人或小鼠LAG-3的过表达会抑制T细胞产生IL-2，而这一抑制作用可通过anti-LAG-3阻断抗体逆转，相关结果已有报道。同样使用表达I-Ad/k并负载OVA 323-339同源肽段的LK35.2小鼠B细胞系刺激DO11.10小鼠CD4+ T细胞杂交瘤，并观察到抗小鼠LAG-3 D1 M8抗体可完全恢复由LAG-3介导的T细胞抑制作用（图1B）。

为了明确pMHC II类分子在LAG-3功能中的具体作用，采用了一种简化的策略，使用经过改造的基于HEK293T的人工抗原呈递细胞系（aAPC），该细胞系不表达MHC II分子以及上述的配体/受体对（图1A,C）。首先对该aAPC系进行工程改造，使其过表达小鼠pMHC II分子，例如共价结合OVA 323-339肽段的I-Ad或结合HEL 48-62肽段的I-Ak。为了进一步确认这些aAPC是否能够与LAG-3相互作用，开发了一种LAG-3 CAR检测系统，其中LAG-3的ICD被第三代CAR设计的信号结构替换。此外，在表达LAG-3 CAR的Jurkat T细胞中引入了NF-κB GFP报告系统，用于检测LAG-3配体的结合情况。利用这一检测系统，发现表达I-Ad OVA 323-339 pMHC II分子的aAPC能够显著激活小鼠LAG-3 CAR信号，而该信号可被M8抗体阻断（图1D,E）。将pMHC II分子替换为跨膜锚定的FGL1（FGL1-TM），但不是LSECtin或半乳糖凝集素-3，也能引发强烈的LAG-3 CAR信号。同样，可溶性的寡聚形式但非二聚体形式的FGL1能够触发有效的CAR激活，这表明有效的LAG-3结合需要高阶寡聚化或膜交联。与B细胞系统类似，还发现I-Ad OVA 323-339 aAPC在与表达同源TCR的DO11.10 T细胞杂交瘤共培养时，能够重现LAG-3介导的抑制作用（图1F,G）。此外，使用识别3A9 T细胞杂交瘤上表达的同源TCR的I-Ak HEL 50-62 pMHC II aAPC进一步验证了这些发现（图1H-K）。

为了研究在存在同源pMHC II分子的情况下人LAG-3的功能，同样构建了一种表达HLA-DR1 HA 306-318 pMHC II的aAPC。发现该细胞系能够与人LAG-3相互作用，并触发LAG-3 CAR信号通路（图1L,M）。重要的是，由人pMHC II分子引发的LAG-3 CAR信号可被抗人LAG-3抗体relatlimab或抗人HLA-DR抗体（clone L243）所阻断（图1L,M）。 为了研究LAG-3在人类T细胞抑制功能中的作用，还在一种缺乏TCRβ链的CD4+ Jurkat J.RT3-T3.5细胞系中表达了HLA-DR1 HA 306-318 pMHC II的同源TCR HA1.7以及NFAT-GFP报告系统。当存在HLA-DR1 HA 306-318 aAPC时，过表达人类LAG-3显著降低了GFP报告信号（图1N），而relatlimab能够逆转这种抑制作用（图1N,O）。尽管L243抗体在没有LAG-3的情况下略微降低了T细胞激活，但在LAG-3存在的情况下却促进了T细胞激活，表明其主要作用是阻断MHC II/LAG-3结合而非MHC II/TCR结合。综合这些数据验证了LAG-3在CD4+ T细胞上通过pMHC II分子介导的抑制功能。

图1 LAG-3在同源pMHC II分子存在下介导CD4+ T细胞的抑制作用

LAG-3与TCR的空间接近性而非与CD4共受体的接近性对于其在CD4+ T细胞上的抑制作用至关重要

自发现LAG-3与MHC II分子之间的相互作用以来，MHC II分子如何通过LAG-3介导T细胞抑制一直是尚未解决的问题。鉴于MHC II分子既可以与LAG-3结合，也可以与CD4共受体结合，探究了在同源pMHC II分子存在的情况下CD4在LAG-3功能中所起的作用。分离出一个CD4阴性的DO11.10小鼠T细胞杂交瘤克隆，并发现小鼠LAG-3仍能像在CD4阳性克隆中一样有效地抑制T细胞活化。此外，利用CRISPR-Cas9系统在DO11.10 T细胞中敲除CD4，结果表明LAG-3的功能仍然保留。这些数据明确表明，在缺乏CD4的情况下，LAG-3依然具有抑制功能。为了进一步分析LAG-3的功能是否依赖于干扰CD4/Lck的相互作用，在CD4敲除的细胞中重新引入了野生型CD4（WT）或一种CD4-Lck嵌合受体（CD4tmLck），后者将CD4的胞内域替换为Lck。当这些表达CD4 WT或CD4tmLck的DO11.10 T细胞被OVA 323-339肽脉冲处理的LK35.2 B细胞或I-Ad OVA 323-339 aAPC激活时，发现LAG-3仍然表现出相同的抑制效果。还使用I-Ak HEL 50-62 aAPC刺激重新表达了CD4 WT或CD4tmLck的CD4敲除3A9细胞，也未观察到LAG-3抑制作用的差异。这些结果表明，至少在同源pMHC II分子存在的情况下，LAG-3的T细胞抑制功能并不依赖于CD4的存在。

MHC II分子可以以一种同源肽限制性的方式同时结合LAG-3和TCR。为了区分MHC II分子与LAG-3之间的相互作用和MHC II分子与TCR之间的相互作用，建立了一个实验系统，使用另一种表达膜锚定（MT）抗小鼠或人CD3 scFv（anti-CD3 MT）的aAPC来激活CD4+ T细胞，而不是使用同源pMHC II类分子（图2A）。之前曾用类似的系统在人类基因组中筛选T细胞抑制性分子。也通过构建三个anti-CD3 MT表达水平逐步升高的克隆来调节T细胞激活强度（图2B,C）。然而，发现当非同源pMHC II分子（pMHC II NC，I-Ab OVA 323-339）仅能结合LAG-3而不能结合3A9 TCR时，在这些条件下并未介导对LAG-3 + 3A9 T细胞的抑制作用（图2D）。在比较有或无LAG-3过表达、有或无LAG-3抗体阻断的情况下，也没有观察到LAG-3依赖性的抑制作用（图2E-H）。当使用表达抗人CD3 MT的aAPC，并以I-Ab OVA 323-339作为pMHC II NC，该系统产生的LAG-3 CAR信号与人HLA-DR1 HA 306-318相似，但同样未观察到人LAG-3在携带HA特异性TCR的人Jurkat T细胞中的抑制作用。相反，发现该anti-CD3 MT aAPC系统能够显示出人PD-L1/PD-1介导的T细胞抑制作用。这些结果与使用同源pMHC II分子所得的数据形成鲜明对比（图1）。尽管LAG-3可以在同时存在LAG-3和TCR结合的同源pMHC II分子条件下介导T细胞抑制，但当MHC II分子与TCR解耦后，其功能则显著受损。

随后提出假设，认为LAG-3可能需要在顺式结构中与TCR保持空间上的接近性，而这种接近性通常由同源pMHC II分子介导，从而发挥其对T细胞的抑制作用。利用共聚焦显微镜，在培养携带HA TCR的Jurkat T细胞时，观察到无论是HLA-DR1 HA 306-318 pMHC II分子还是pMHC II NC aAPC（表达抗人CD3 MT），均能形成免疫突触。然而，当Jurkat T细胞被同源pMHC II分子aAPC激活时，LAG-3与TCR的共定位程度明显更高。

为了增强pMHC II NC /LAG-3轴与TCR-CD3复合物之间的共定位和空间接近性，采用了一种化学诱导接近性实验方法，人为地将它们拉近。使用了雷帕霉素的一种免疫抑制作用较弱的类似物rapalog（AP21967），它能够与FK506结合蛋白（FKBP12）以及mTOR的T2089L突变型FKBP-雷帕霉素结合域（FRB）形成三元复合物。在该实验中，将pMHC II NC（I-Ab OVA 323-339）与FKBP12融合，并将抗小鼠CD3 MT与FRB在其各自的ICD中融合（图2I-K）。加入rapalog后，这些分子可以形成异二聚体/寡聚体（图2I）。有趣的是，发现当表达LAG-3时，rapalog能够诱导出更强的3A9 T细胞抑制效应（图2L,M）。在使用DO11.10 CD4+ T细胞和I-Ak HEL 50-62作为pMHC II NC的实验中也得到了类似的结果（图2N）。综合来看，这些实验结果表明，TCR的空间接近性对于MHC II分子/LAG-3介导的CD4+ T细胞抑制至关重要。

图2 TCR的接近性对于MHC II分子/LAG-3介导的CD4+ T细胞抑制至关重要

LAG-3 ICD与CD3ε结合，并破坏CD3ε/Lck的凝聚

鉴于观察到LAG-3在CD4+ T细胞上的抑制功能主要不依赖于CD4共受体或CD4/Lck相互作用的破坏，至少在存在同源pMHC II分子的情况下是如此，因此试图探究LAG-3是否可以直接影响TCR近端信号传导。此前，发现在溶液系统和支撑脂双层（SLB）系统中，Lck可特异性地与CD3ε ICD中的富含碱性氨基酸序列（BRS）结合，而不是其他CD3亚单位。有趣的是，在此发现人LAG-3 ICD可以与非磷酸化和双磷酸化的CD3ε形成凝聚物，但不能与单磷酸化的CD3ε形成凝聚物，表明这是一种多价相互作用（图3A,B）。进一步研究了ICD内部对CD3ε/LAG-3凝聚物形成重要的区域。将CD3ε中对Lck凝聚物形成至关重要的BRS突变，但不是富含脯氨酸序列（PRS）或RK基序，会阻断与LAG-3的凝聚物形成（图3C,D）。在人LAG-3中，发现F483A/L486A突变也破坏了与CD3ε的凝聚物形成（图3E,F）。

接下来，探讨了LAG-3是否可以直接影响CD3ε/Lck的凝聚。作为一种对Zap-70结合磷酸化CD3 ITAM至关重要的激酶，Lck在Y505位点磷酸化时会处于自抑制的闭合状态。为了模拟其开放形式，使用了两种Lck变体：K273R/Y505F（Lckopen）以及LckUD-SH3-SH2，后者是一种截短型Lck，去除了自抑制性的C端尾巴，能够与CD3ε形成类似全长开放形式Lck的凝聚物。我们发现，LAG-3在SLB上显著阻止了双磷酸化CD3ε与Lckopen或LckUD-SH3-SH2之间的凝聚物形成（图3G-J）。而对于非磷酸化的CD3ε，LAG-3 ICD对Lckopen和LckUD-SH3-SH2所介导的凝聚几乎无影响（图3G-J）。有趣的是，确实观察到LAG-3对非磷酸化CD3ε与LckUD-SH3之间的凝聚有一定影响，而LckUD-SH3是凝聚形成的最小结构域。综合来看，这些数据表明LAG-3可能影响不同状态下的Lck/CD3ε相互作用，并更倾向于破坏完全激活状态的双磷酸化CD3ε。

与其他检查点受体（如PD-1或CTLA-4）的ICD相比，LAG-3 ICD在破坏CD3ε-Lck相互作用方面表现出特异性（图3K）。接着检测了FSAL基序（这一参与与CD3ε形成凝聚物的关键区域）是否也介导了其对CD3ε-Lck凝聚的影响。FSAL基序中的丙氨酸突变显著降低了人和小鼠LAG-3 ICD对SLB上双磷酸化CD3ε与LckUD-SH3-SH2形成凝聚物的作用（图3L-O），同时也削弱了LAG-3抑制T细胞反应的功能（图3P-S）。还发现，EP基序的缺失强烈影响LAG-3/CD3ε的凝聚。此外，这一缺失至少部分阻止了LAG-3对双磷酸化CD3ε与LckUD-SH3-SH2之间凝聚形成的干扰。相比之下，LAG-3 KIEELE缺失突变体仅轻微影响LAG-3/CD3ε的凝聚，但并不破坏CD3ε/Lck之间的凝聚形成。

还建立了一种基于微珠的检测方法，用于测量LAG-3与CD3ε ICD之间的直接相互作用。在饱和浓度下，F483A/L486A突变完全消除了LAG-3与CD3ε的结合。通过改进的微珠检测法来定量Lck与CD3ε的相互作用，发现LAG-3显著降低了pCD3ε/LckUD-SH3-SH2或CD3ε/LckUD-SH3结合的信号，而其F483A/L486A突变体则无此效果。为了探索LAG-3在细胞水平上对Lck/TCR-CD3相互作用的抑制证据，建立了基于HEK293T细胞的重建系统，表达HLA-DR1限制性TCR（E8）、CD3亚基、Lck、LAG-3或F483A/L486A突变体。随后，这些细胞在有或没有relatlimab的情况下，被表面固定的HLA-DR1-磷酸丙糖异构酶（TPI）特异性肽复合物刺激，以检测人LAG-3的抑制作用。观察到，LAG-3野生型显著抑制了TCR-CD3/Lck共定位的比例，而F483A/L486A突变体则无此作用。与共定位结果一致，也发现LAG-3抑制了TCR簇集的数量和大小。综上所述，这些研究系统地解析了LAG-3 ICD与特定CD3亚基之间的物理相互作用及其在功能上对CD3ε-Lck结合的影响，从而导致在识别同源MHC II分子时，CD4+ T细胞中TCR近端信号传导受到抑制。

图3 LAG-3 ICD破坏CD3ε/Lck凝聚

LAG-3/TCR双特异性抗体以LAG-3依赖的方式强烈抑制CD4+和CD8+ T细胞反应

为了利用LAG-3通过顺式接近性实现的TCR抑制机制，研究了抗体介导的增强LAG-3与TCR接近性能否诱导依赖LAG-3的T细胞抑制，并将这种效应扩展到CD4+ T细胞以外。为此，开发了一种能够同时结合小鼠LAG-3和TCR的双特异性抗体（图4A）。采用串联scFv设计，并融合单链IgG1 Fc以延长半衰期，同时引入N297G突变以最小化Fc效应功能（图4A）。其中结合TCR的scFv来源于抗小鼠TCR Cβ抗体H57-597，该抗体在单价形式下表现出较弱的TCR抑制活性；另一个scFv则来源于小鼠LAG-3 M8抗体。将这种针对小鼠LAG-3/TCR的双特异性T细胞沉默抗体命名为BiTS（图4A）。此前的表位定位研究表明，H57-597结合于TCR Cβ的F-G环，而M8结合于LAG-3 D1结构域的F-G环（TVRLPNR），这与如relatlimab等结合大环1的抗体不同。证实M8在体外能有效抑制LAG-3功能，并可在小鼠中控制MC38肿瘤生长，其效果与靶向LAG-3 D2二聚体的C9B7W抗体相当。作为对照，在M8的CDR3重链区域引入四个突变，生成一种突变型BiTS（BiTS mut），其仍可结合TCR但对LAG-3的结合能力显著降低（图4A,B）。BiTS mut影响其对LAG-3+ T细胞的结合，但不影响对LAG-3- T细胞的结合。首先在由anti-CD3 MT aAPC刺激的CD4+和CD8+ T细胞杂交瘤中测试BiTS的功能，而在这些体系中LAG-3本身未表现出明显功能活性（图2）。BiTS在LAG-3+ T细胞中显示出剂量依赖性的IL-2分泌显著减少，但在LAG-3−模拟T细胞中的作用则弱得多，且效果优于BiTS mut（图4C-E）。在高于10nM的浓度下，BiTS mut也表现出一定程度的T细胞抑制，提示其单价anti-TCR臂具有直接的抑制作用。因此，在表达高水平LAG-3的这些LAG-3+ 杂交瘤中，结合LAG-3可以带来更强效的T细胞抑制。

接下来，在同源pMHC刺激的背景下测试了BiTS。CD4+ 3A9细胞通过稳定表达CD86的I-Ak HEL 50-62 aAPC进行激活，而CD8+ B3Z细胞则通过负载OVA 257-264的mutuDCs激活。同样，在使用BiTS而非BiTS mut处理时，经pMHC II和pMHC I刺激的LAG-3+ CD4+ 和CD8+ T细胞均表现出明显的IL-2水平下降（图5A-C）。还构建了另一种双特异性对照BiTS，将BiTS中的LAG-3结合臂替换为无关抗体（抗溶菌酶）（Ly/TCR）。与LAG-3/TCR BiTS在LAG-3+ 细胞中表现出强效的CD8+ T细胞抑制作用不同，Ly/TCR BiTS在LAG-3+ 与亲本CD8+ T细胞之间未显示出功能差异（图5D）。类似于Ly/TCR BiTS，也在高浓度下观察到LAG-3/TCR BiTS对LAG-3−亲本CD8+ T细胞产生了一定程度的T细胞抑制作用，进一步证实了单价抗TCR臂具有一定的抑制效应。还发现，LAG-3/TCR BiTS并不影响MHC I四聚体在OVA 257-264特异性的TCR转基因OT-1 T细胞上的染色。综上所述，这些数据表明，开发的LAG-3/TCR BiTS所展现出的强效抑制作用依赖于LAG-3的存在，并且并未影响其他相互作用如pMHC I/TCR的结合。

还基于抗人LAG-3抗体relatlimab和抗小鼠TCR的H57-597抗体开发了另一种LAG-3/TCR BiTS。发现这种BiTS能够降低表达人LAG-3的小鼠CD4+ 和CD8+ T细胞中的IL-2水平。还测试了小鼠LAG-3/TCR BiTS在T细胞调控中是否依赖共受体。已有研究报道，共受体CD8和CD4可稳定并增强TCR信号传导。然而，当检测BiTS对缺乏CD4或CD8的T细胞杂交瘤的作用时，仍观察到对IL-2产生的强烈抑制。这些结果共同表明，LAG-3/TCR BiTS能够在不依赖共受体的情况下抑制CD4+ 和CD8+ T细胞对同源pMHC的反应。

图4 LAG-3/TCR BiTS介导LAG-3依赖性的T细胞抑制

图5 LAG-3/TCR BiTS有效抑制抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞反应

LAG-3/TCR BiTS强效抑制抗原特异性CD8+T细胞反应及1型糖尿病的发生

接下来，进一步评估了BiTS在小鼠原代T细胞中的功能。将OT-I TCR转基因小鼠与Lag3−/−小鼠或WT同窝小鼠杂交，以获得有或没有LAG-3表达的CD8+ OT-I T细胞（图6A）。随后，用负载了OVA 257-264同源肽的mutuDC体外刺激幼稚的脾脏CD8+ OT-I T细胞。将BiTS加入共培养体系后，发现其可抑制WT OT-I T细胞中IL-2和IFN-γ的产生，而这种抑制作用在Lag3−/− T细胞中或BiTSmut在低于10nM浓度下应用时并未观察到（图6B,C），尽管BiTSmut在更高浓度下可能具有抑制作用。还观察到，BiTS以剂量依赖的方式抑制了OT-I WT而非OT-I Lag3−/−的IL-2产生。此外，对用SIINFEKL肽脉冲处理的mutuDC刺激的OT-I T细胞进行了整体RNA-seq分析，发现与同型对照或BiTSmut相比，BiTS处理组的T细胞特征基因（如IFNγ、IL23a）显著下调，但BiTSmut与同型对照之间未见明显差异。为了探索BiTS在体内效应，使用了大鼠RIP-OVA自身免疫性糖尿病模型，在该模型中，过继转移抗原特异性OT-I T细胞可诱导糖尿病的发生，并且靶向PD-1会导致疾病加速。发现，在RIP-OVA模型中给予BiTS治疗（第2-8天，隔日一次[q.o.d.] 0.75mg/kg），可显著防止糖尿病的发展，表现为糖尿病发生率下降，而BiTSmut则未能提供显著保护（图6D,E）。对胰腺组织的组织学评估也显示，BiTS处理的小鼠中CD8+ T细胞浸润以及胰岛周围炎和胰岛炎的发生率均有所降低（图6F,G）。

图6 LAG-3/TCR BiTS抑制CD8+ T细胞活化及糖尿病的发生

LAG-3/TCR BiTS在CD8 T细胞肝炎和多发性硬化的小鼠模型中具有治疗作用

接下来，探索了BiTS在其他自身免疫疾病中的治疗潜力。高达40%的儿科急性肝衰竭（PALF）病例病因未明。最近的一项研究发现，与确诊的PALF患者（Dx-PALF）相比，病因未定的PALF患者（IND-PALF）体内记忆样CD8+ T细胞的数量更高。遗憾的是，对于那些患有所谓"活化CD8+ T细胞性肝炎"的IND-PALF患者，目前可用的治疗方法只有皮质类固醇或肝移植。

重新分析了来自PALF患者的RNA-seq数据，并发现与Dx-PALF患者相比，在IND-PALF患者的肝脏中，LAG-3及其他共抑制受体（如CTLA-4、PDCD1）、CD8A/CD8B、Th1相关基因特征（如TNFRSF9（4-1BB）、TNF、IFNG、CXCL9/10/11），以及T细胞激活和信号传导通路（如CD69、GZMA/H/K、PRF1、LCK、IL2RG、TOX、EOMES）均显著上调（图7A,B）。随后，在先前建立的记忆样CD8+ T细胞介导的肝炎模型中探索了BiTS的作用。在此模型中，经抗4-1BB激动剂抗体处理后，肝脏CD44+ CD8+记忆T细胞扩增，从而导致炎症、肝炎及慢性肝病。这些CD8+ T细胞通过促进肝脏炎症发挥关键作用，其方式依赖于IFN-γ，类似于IND-PALF活化CD8 T细胞肝炎的表型（图7A,B）。与之前的结果一致，观察到抗4-1BB处理后出现肝炎及肝脏损伤（图7C,D）。值得注意的是，BiTS处理（第6-10天，每日一次，0.75mg/kg）显著减少了CD8+ T细胞浸润及肝脏损伤（图7D）。相比之下，BiTS mut处理的小鼠在CD8+ T细胞浸润及肝脏损伤方面几乎没有减少或无明显变化。有趣的是，发现肝炎期间LAG-3+ CD8+细胞比例显著增加，而BiTS处理后该细胞群略有下降但不显著。还对肝脏匀浆中的炎症细胞因子进行了检测，结果显示BiTS处理小鼠的IFN-γ、TNF-α、IL-12p70以及MCP-1水平降低，而BiTS mut处理小鼠则未见类似变化。重要的是，在体内BiTS处理后，CD8+ T细胞在体外再刺激时分泌的IFN-γ极少，而在本模型中IFN-γ对于诱导肝脏髓系细胞产生其他细胞因子/趋化因子（如TNF-α、MCP-1等）至关重要。BiTS处理还大幅降低了这些致病性CD8+ T细胞的比例和数量。

为了更深入地了解BiTS处理后的细胞和分子变化，对经PBS或BiTS处理的肝炎小鼠肝脏中的免疫细胞进行了scRNA-seq。利用UMAP进行降维，并通过后续的无监督聚类分析，鉴定了九种不同的细胞类型（图7E）。与健康小鼠相比，在肝炎小鼠中观察到大量CD8+ T细胞的存在（图7E,F）。与流式细胞术数据一致，发现与CD4+ T细胞（或NKTs）相比，BiTS处理显著减少了CD8+ T细胞亚群的比例（图7F）。通过CellphoneDB分析，发现BiTS处理显著降低了CD8+ T细胞与髓系细胞之间的相互作用数量以及特定相互作用配体-受体对的表达水平。

对CD8+ T细胞功能标志物的表型分析表明，Mki67（Ki67，增殖）、CD69（早期活化）、细胞毒性特征（Gzma/b/k、Prf1）和细胞因子（IFN、TNF）发生了显著变化。为进一步刻画炎症性CD8+ T细胞群体，利用已发表的基因表达特征区分效应型和记忆型表型。分析揭示了三个群体：一个富集了中枢记忆型基因表达特征，与之前报道的记忆表型一致；另一个富集了效应型基因表达特征（图7G-I）。其中一个簇表现出最高的中枢记忆型基因表达特征，并表达了中枢记忆T细胞相关基因（如Xcl1、Tcf7、Ccr7）（图7G-I）。另外两个簇则表现出驻留记忆型基因表达特征（如Itgae [CD103]、Id3、Zeb2、Il7r、Klf2）（图7G-I）。其余簇主要表达效应相关基因（如Lag3、Tnfrsf9、Pdcd1、Gzmb）（图7G-I）。有趣的是，虽然LAG-3在效应样CD8+ T细胞群体中表达更为显著，但BiTS处理主要减少了中枢记忆样和驻留记忆样CD8+ T细胞亚群（图7I）。拟时序分析提示效应样簇与中枢记忆样或驻留记忆样簇之间可能存在相互转化。综合这些发现表明，BiTS在影响T细胞活化、增殖以及向中枢/驻留记忆T细胞分化方面发挥了重要作用。

糖尿病和肝炎模型主要是由CD8+ T细胞介导的自身免疫性疾病模型，因此探索了对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的治疗，这是一种主要由CD4+ T细胞介导的多发性硬化模型。为小鼠设定了预防性和治疗性两种给药方案，分别在疾病症状出现前（第6-10天，每日给药，1.2 mg/kg）或疾病症状高峰期前（第13-21天，隔日给药，1.2 mg/kg）给予BiTS治疗。BiTS治疗的小鼠表现出较低的临床评分。综上所述，LAG-3 BiTS代表了一种由CD8+和/或CD4+ T细胞引起的自身免疫性疾病的有前景的治疗策略。

图7 LAG-3/TCR BiTS改善CD8+ T细胞介导的肝炎

总结

综上所述，研究明确了LAG-3与TCR-CD3在近膜端的相互作用（这种作用由特异性的pMHC II分子介导）在T细胞抑制中的关键角色。强调了LAG-3作为一种具有强大检查点功能的受体，能够干扰早期TCR信号传导，但其活性受到"条件性"配体结合的严密调控，例如特异性与非特异性pMHC II分子（或如其他研究所提出的FGL1的不同形式）之间的差异。这种条件性可能解释了LAG-3在生理功能上不如PD-1显著，以及其作为检查点阻断靶点时效果有限的原因。尽管relatlimab已获批准，但LAG-3单药治疗缺乏强效的单药活性。研究揭示的LAG-3生物学特性为抗体设计提供了新思路，即模拟其条件性配体的作用，以最大限度地实现依赖LAG-3的T细胞抑制，用于治疗自身免疫疾病。LAG-3 BiTS作用机制也不同于依赖Fc的LAG-3耗竭型抗体项目，以及一种可能具有激动活性的LAG-3单克隆抗体。这些发现不仅深化了对LAG-3生物学的理解，也为开发基于顺式邻近作用机制的自身免疫疾病治疗策略提供了支持。

这里的简化系统主要关注T细胞中MHC II分子与LAG-3的相互作用，可能无法涵盖涉及其他LAG-3配体或表达LAG-3的B细胞或髓系细胞的机制。尽管认为在CD4+ T细胞中，LAG-3与TCR的顺式邻近作用比LAG-3与CD4或LAG-3与非特异性pMHC II分子的相互作用更为重要，但后一种机制在某些条件下仍可能发挥一定作用。除了CD3ε/Lck凝聚外，其他LAG-3机制，如胞外域功能和替代信号通路，也可能参与T细胞抑制。虽然LAG-3/TCR BiTS显示出强烈的依赖于LAG-3的T细胞抑制作用，但TCR抑制、LAG-3信号传导以及其他机制（如TCR/LAG-3膜清除和潜在的跨式效应）的相对贡献仍有待进一步明确。特别是在人类系统中，使用不同TCR或LAG-3结合分子的研究可能有助于阐明这些机制。

Du J, et al. Proximity between LAG-3 and the T cell receptor guides suppression of T cell activation and autoimmunity. Cell. 2025 Jun 30: S0092-8674(25)00638-5.

Jiang Y, et al. Ligand-induced ubiquitination unleashes LAG3 immune checkpoint function by hindering membrane sequestration of signaling motifs. Cell. 2025 May 1;188(9):2354-2371.e18.

Adam K, et al. Cutting Edge: LAG3 Dimerization Is Required for TCR/CD3 Interaction and Inhibition of Antitumor Immunity. J Immunol. 2024 Jul 1;213(1):7-13.