子宫肌瘤FH蛋白免疫组化结果不一，NGS检出FH新型胚系突变

本研究详细分析了与遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（HLRCC）相关的子宫肌瘤的临床和遗传特征，并结合家族史、病理学及管理流程的探索，辅以全面的证据收集。研究人员从先证者处采集血样，并通过Sanger测序验证致病变异。开展了家族史综合回顾、FH缺陷病理学分析、FH和2SC免疫组织化学染色检测。功能证据源于临床和遗传信息，并辅以文献收集，最终基于ACMG/AMP指南对变异进行重新分类。本研究成功检出FH基因9号外显子的新型错义突变（c.1240A>G；p.Lys414Glu），该突变在现有数据库中尚无报道。基于患者表型、家族史及文献收集的证据，该变异被初步判定为可能致病。研究人员还强调了结合FH缺陷形态学与2SC免疫组织化学染色以提高检测敏感性的重要性。本研究为FH基因变异库新增了一种新型错义突变，基于表型、家族史及文献证据的多维度分析，强调了其可能的致病性质。研究结果深化了对FH相关遗传频谱的理解，并强调了全面特征分析对准确变异分类的重要性。

背 景

遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（HLRCC）综合征是一种极为罕见的遗传性疾病，其特征为皮肤平滑肌瘤（CLMs）、子宫平滑肌瘤（ULMs）、肾囊肿（RCys）和肾细胞癌（RCC）。其临床表现包括皮肤或子宫平滑肌瘤，常伴发侵袭性肾细胞癌，全球范围内尚无患病率报道。子宫平滑肌瘤通常发生于 30-50 岁女性，但在HLRCC背景下，女性可能早在 28-32 岁即出现多发性平滑肌瘤，其特点为体积大且数量多。值得注意的是，子宫平滑肌瘤是HLRCC中最常见的特征，预计 80-90% 的女性受累。这些平滑肌瘤表现为早发、多发、体积大及症状性表现，最终需行肌瘤切除术，部分病例需行子宫切除术。

延胡索酸水合酶（FH）基因包含 10 个外显子，跨越 22.15 kb的DNA序列，在不同物种间高度保守。FH基因定位于染色体1q42.3-43区域，作为抑癌基因，编码延胡索酸水合酶，该酶在线粒体三羧酸（TCA）循环和细胞核DNA双链断裂修复中均起关键作用。FH基因突变会导致延胡索酸水合酶活性降低或缺失，从而升高细胞内延胡索酸水平。这种水平升高会阻碍缺氧诱导因子（HIF）脯氨酰羟化酶的功能，促使HIF-α积累。随后，HIF-α激活启动HIF通路，该通路与肿瘤发生和转移密切相关。FH基因的致病变异可能在单等位基因携带者或双等位基因携带者中诱导HLRCC。

本文揭示了一种此前未报道的FH错义突变c.1240A>G:p(K414E)，位于9号外显子。该突变作为与HLRCC相关的胚系突变此前未见报道，通过分离分析、血液和肿瘤分子检测及全面的生物信息学评估等严格审查，被判定为可能致病性。

病 例

患者女（III-4），35 岁，就诊于山东省聊城市人民医院，主诉罹患子宫肌瘤超过六年，伴经量过多持续一年以上。其家族史阳性，有一位健康的弟弟（III-2）和两个妹妹（III-3及III-5）--两位妹妹均于 30 岁时被诊断为子宫肌瘤，其中妹妹行肌瘤切除术，姐姐选择子宫切除术。遗憾的是，其父（II-3）50 岁时因肾集合管癌去世，母亲（II-4）体健。患者家族史还涉及姑姑（II-1）及其女儿，二人均被诊断为子宫肌瘤。此外，曾祖母（I-1）有子宫肌瘤病史，已故（图1）。盆腔超声检查显示存在一个轮廓不规则的子宫结构，可见多个低回声团块，其中最大者大小为 85×72 mm（图2）。

▲图1 患者家系

▲图2 本例子宫平滑肌瘤的超声图像

患者接受了经腹子宫肌瘤剔除术，开腹可见子宫大小如孕 6 个月，形态不规则。肌壁间可见多个明显突出的肌瘤，较大者位于子宫前壁及子宫下段后壁，直径 8-10 cm。值得注意的是，共切除了 20 余个大小不等的肌瘤。双侧卵巢及输卵管外观正常，无明显异常。鉴于患者家族中存在子宫肌瘤及肾细胞癌病史，建议患者进行基因检测以排除胚系突变。检测发现其FH基因9号外显子存在c.1240A>G（p.Lys414Glu）突变，根据基因数据库分类为意义未明变异（VUS）。然而，患者家族成员因个人原因拒绝进行基因检测。

研究方法

患者选择

尽管目前缺乏既定诊断标准，但仍可选择表现出HLRCC典型临床表型的患者。由Smit和Schmidt等人提出的修订诊断标准，界定了临床诊断的实用参数，包括两项主要标准和四项次要标准。主要标准包括：①存在多发性皮肤平滑肌瘤，尤其是伴有特征性刺痛者；②出现一个或多个伴有特征性刺痛的毛平滑肌瘤。次要标准包括：①孤立性皮肤平滑肌瘤合并遗传性平滑肌瘤病及肾细胞癌综合征家族史；②40 岁前发生2型乳头状肾细胞癌；③女性40岁前出现症状严重的子宫平滑肌瘤；④存在符合上述任一标准的一级亲属。父系二级亲属 40 岁前出现症状严重的子宫平滑肌瘤也具有相关性。若患者符合主要标准，则诊断可能成立。若患者符合两项或更多次要标准，则需怀疑HLRCC，需通过免疫组化或基因测序等额外检查辅助确诊，因最终确诊需胚系延胡索酸水合酶基因突变检测阳性。

免疫组化

研究人员对FH及S-(2-琥珀酰基)-半胱氨酸（2SC）进行了免疫组织化学染色。实验中使用的一抗包括FH（克隆号J-13）和2SC（多克隆抗体），染色过程严格遵循抗体说明书及实验室规范中详述的实验条件。阳性对照和阴性对照的标准操作均被严格执行。FH和2SC的判读标准依据相关参考文献制定。

FH突变检测

研究人员选择取自外周血样本的DNA作为FH基因检测的底物。通过聚合酶链反应扩增及Sanger测序对整个编码序列及外显子-内含子边界进行了全面分析，重点关注单核苷酸变异及插入/缺失变异。所识别变异的描述遵循现行版本的人类基因组变异搜索命名法，其中转录本参考序列为NM_000143.4。

功能证据分析

鉴于延胡索酸水合酶（FH）具有多样化功能，研究团队开展了广泛的文献综述与数据库检索，以汇总关于FH基因9号外显子错义突变c.1240A>G（p.Lys414Glu）特性的信息，旨在收集有助于解读该基因变异致病性的依据。针对FH错义突变c.1240A>G，研究人员在千人基因组计划（1000 Genomes）、外显子组聚集联盟数据库（ExAC）、基因组聚集数据库（gnomAD）及韩国人群基因组变异数据库（iJGVD）等数据库中进行了分析，以明确其等位基因频率，从而提供证据支持。此外，对突变位点的进一步探究涉及ClinVar、OncoKB、VarSome等突变数据库，从现有文献或病例报告中提取证据。研究团队还系统检索了涉及FH错义突变c.1240A>G的相关出版物，并基于功能研究、临床试验、共分离分析、疾病发生率及其他相关因素对证据等级进行了赋值。随后，依据美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学会（ACMG/AMP）制定的标准，对FH c.1240A>G（p.Lys414Glu）变异进行了分类。

研究结果

临床特征

该家系中的六位女性均患有子宫肌瘤，每个人均在 30 岁前接受了肌瘤切除术。此外，其中两人进一步接受了子宫切除术（分别在 32 岁和 40 岁时）。所有女性患者均表现出大量出血和/或肿块症状，且对药物治疗无效；术前超声检查随后证实其存在多发、较大的肌瘤。

病理发现

大体检查可见超过 20 个结节样结构，直径范围为 0.4-8 cm。切开面呈现细腻的灰黄色调，质地坚韧，具有独特的漩涡状或水肿样外观（图3）。

▲图3 子宫平滑肌瘤样本

镜下观察显示，大多数平滑肌瘤表现为细胞密度增高，少数呈现中等细胞构成。其特征性表现包括：血管周细胞瘤样血管（以鹿角状分支血管为特征），以及多灶性间质水肿（图4A）。可见明显的嗜酸性大核仁伴核仁周围空晕，胞质内可见嗜酸性包涵体（由圆形至卵圆形粉红色小体组成）。局灶性区域可见细胞核异常（表现为增大、形态不规则、深染及多核现象）（图4B）。免疫组化分析显示，平滑肌瘤细胞中FH表达缺失，与邻近血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的阳性染色形成对比（图4C）。反之，所有子宫平滑肌瘤细胞2SC均呈阳性染色，支持FH缺失（图4D）。然而，对先证者的 8 例平滑肌瘤样本进行FH和2SC免疫组化分析时发现：其中 5 例FH染色阴性，3 例FH染色阳性，但值得注意的是所有 8 例样本2SC均呈阳性染色。通过FH基因测序（图5）确认了胚系突变，显示不同平滑肌瘤间染色模式存在差异--部分区域保留染色，部分区域染色缺失，提示FH染色模式具有异质性。FH免疫组化染色结果与平滑肌瘤类型或FH-d形态学程度之间未观察到显著相关性。基于聚合酶链反应（PCR）的Sanger测序证实存在胚系突变（具体为9号外显子c.1240A>G[p.Lys414Glu]），在外周血及肿瘤组织中均检测到该突变。

▲图4 FH缺陷子宫平滑肌瘤的组织病理学和免疫组织化学

▲图5 患者的Sanger结果

证据收集

针对这一此前未被明确报道为有害的错义突变，研究人员开展了全面的证据检索以评估其临床意义。根据GenBank信息，人类延胡索酸水合酶（FH）转录本NM_000143.4包含 1791 个碱基，编码 510 个氨基酸，跨越 10 个外显子，其中FH c.1240A>G(p.Lys414Glu)变异位于9号外显子。在千人基因组计划（1000 Genomes）、外显子组聚集联盟数据库（ExAC）、基因组聚集数据库（gnomAD）及韩国人群基因组变异数据库（iJGVD）中均未检索到FH c.1240A>G(p.Lys414Glu)突变位点的记录，且OncoKB数据库也无相关提及。ClinVar数据库报告的证据提示其功能影响意义未明（低级别分类）。Liang Zheng等人在研究中报道，FH Lys414Glu突变体表现出稳定特性，但在肾细胞癌（RCC）中其正常活性丧失超过 80%。

基于Mutation Taster在线预测及整合预测工具REVEL（均提示该变异为"致病"），以及剪接预测软件（NNSplice、NelGene2、FSPLICE、SpliceAI）提示该突变不影响剪接，存在一致证据支持其存在潜在有害影响。

VarSome数据库报告其意义未明，证据评分为 2 分（2P-0B）：PM2 Supporting（该变异未在gnomAD中发现）和PP2 Supporting（FH基因中 161 个非意义未明（VUS）错义变异中 156 个为致病性，占比 96.9%，超过 80.8% 的阈值）。

结合系统诊断方法（包括全面的个人及家族史分析），并考虑患者家族性肾细胞癌、子宫肌瘤病史及特定表型，支持遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（HLRCC）的诊断。

根据ACMG/AMP标准，并综合相关证据，可得出结论：FH基因错义突变位点c.1240A>G(p.Lys414Glu)很可能具有致病性（表1）。

▲表1 基于ACMG/AMP指南对FH c.1240A>G(p.Lys414Glu)变异进行重新分类

讨 论

本研究是FH c.1240A>G(p.Lys414Glu)突变在中国遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（HLRCC）人群中的首次报道。值得注意的是，Sánchez-Heras AB等曾在白俄罗斯一名女性中报道过类似突变。尽管先证者亲属不愿接受FH基因测序，限制了额外共分离证据的获取，但FH c.1240A>G(p.Lys414Glu)变异在中国人群中的发现仍是一项重要贡献，也是值得鼓励的报告里程碑。这一新发现强调了对子宫肌瘤（ULMs）、皮肤平滑肌瘤（CLMs）和肾细胞癌（RCCs）进行全面个人及家族史评估的重要性--这是系统诊断方法的核心组成部分。它凸显了需进一步关注与FH基因突变相关的HLRCC相关疾病的诊断、预防和管理，尤其应将子宫肌瘤作为警示性肿瘤重点关注。

意义未明变异（VUS）给临床决策带来挑战，可能使医护人员和收到临床报告的患者产生困惑，甚至引发焦虑。这种不确定性会为患者带来无形负担。通过ACMG/AMP标准分析本例患者检测到的FH c.1240A>G(p.Lys414Glu)变异时，其证据水平最初被定义为PM2、PP2和PP3（均支持VUS分类）。然而，结合先证者详细的家族随访信息及文献全面回顾发现，患者表型和家族史具有高度基因特异性，提供了可归类为PP4的补充证据。此外，Liang Zheng等报道FH Lys414Glu突变体虽稳定，但在肾细胞癌（RCC）中丧失了超过 80% 的正常活性，这与PS3标准一致。综合累积证据，根据ACMG/AMP指南，FH c.1240A>G(p.Lys414Glu)可从VUS重新分类为"很可能致病"。这一重新分类有助于更精准的遗传咨询、优化复发性子宫肌瘤治疗建议及肾肿瘤早期筛查。为推动VUS的重新分类并明确变异与疾病的关联，鼓励患者、医生和实验室协作，重点通过收集全面表型数据、详细家族史、数据库探索及功能分析，为有效管理策略提供依据。

女性HLRCC患者的主要临床场景是出现症状性子宫肌瘤，需在年轻时接受手术干预。这一情况通常发生在肾癌发病之前。一项研究显示，57% 的女性HLRCC患者在 30 岁或之前接受了子宫切除术（平均年龄 30 岁），显著早于肾癌发病（中位年龄通常为 44 岁）。子宫肌瘤作为女性生殖系统最常见的良性肿瘤，因HLRCC综合征的罕见性而存在诊断挑战。若能前瞻性识别这些在肾癌发病前显著更年轻阶段出现子宫肌瘤的患者，将为早期诊断和干预提供独特机会。与HLRCC综合征的罕见性相反，子宫肌瘤极为常见--约 20%-50% 的 30 岁女性受累，80% 的 50 岁女性可能患有子宫肌瘤。尽管多数患者可能无需手术，但子宫肌瘤仍是诊断外科病理实验室中最常见的内脏肿瘤之一。因此，任何旨在识别以子宫肌瘤为首发表现的HLRCC患者的筛查试验必须具备高特异性。

与胚系FH突变相关的子宫肌瘤除数量多、体积大外，还具有独特的形态学特征，包括显著核仁伴合体细胞型核异型、细胞密度增高、核仁周围空晕、鹿角状/血管周细胞瘤（HPC）样血管、胞质小球及间质水肿。

本文研究显示，FH免疫组化染色结果与平滑肌瘤类型或FH-d形态学程度之间无显著相关性。在一名确诊FH胚系突变患者的 8 例平滑肌瘤中，仅 5 例（61.25%）FH免疫组化染色阴性，3 例FH染色阳性；但所有 8 例肿瘤2SC均呈阳性染色。不同平滑肌瘤间观察到FH染色模式的异质性--部分区域保留染色，部分区域染色缺失。FH免疫组化染色的不一致性尚无明确解释，但推测可能与FH基因"二次打击"类型及/或FH蛋白稳定性相关。类似的FH染色异质性在HLRCC患者皮肤平滑肌瘤中也有报道。Bennett等人曾报道 1 例携带FH体细胞错义突变的病例，其FH表达保留且2SC阳性；本研究中，同样纳入了携带FH错义突变、FH染色保留且2SC阳性的平滑肌瘤。这与既往研究报道的FH基因突变相关肾细胞癌（RCC）及皮肤平滑肌瘤中FH免疫组化染色保留的现象一致。在此背景下，2SC免疫组化染色作为检测FH缺陷的方法，表现出更高的可靠性和敏感性。

FH染色保留的现象此前已在确诊胚系或体细胞FH基因突变的子宫肌瘤及RCC中被记录。Emily Chan等人的研究显示，两名携带FH错义胚系突变患者的平滑肌瘤中，肿瘤FH染色保留。该现象被归因于产生了一种虽无功能但仍可被免疫组化检测到的FH蛋白。与之对比，携带FH无义突变、内含子突变及错义突变患者的不同平滑肌瘤间，FH染色表现出不一致性。染色模式的异质性提示突变类型可能影响FH蛋白功能及免疫组化检测的可及性。

本研究强调，FH染色保留不应作为排除FH缺陷或HLRCC的唯一依据。在临床实践中，当遇到具有FH缺陷特征的子宫肌瘤时，会进行FH和2SC染色检测。然而，无论FH染色结果如何，我们的诊断及结论保持一致。这引发了对FH染色价值的思考--其是否仍有持续应用的必要性？对于年轻、具有FH缺陷形态学特征的子宫肌瘤患者，即使FH免疫组化染色保留，也应考虑转诊至遗传咨询及检测。

总结而言，本文报告了 1 例具有显著母系平滑肌瘤家族史（需早期手术干预）的患者。通过检出新型突变FH c.1240A>G(p.Lys414Glu)，研究人员开展了全面的遗传咨询。通过详尽评估完整家族史及其他相关信息，确认了遗传性HLRCC的诊断，并将证据等级从意义未明变异（VUS）提升至"很可能致病"。

此外，研究人员为患者及家属提供了详细的随访指导，包括建议RCC筛查，并提倡通过早期肌瘤剔除术及子宫切除术降低女性HLRCC患者发生子宫平滑肌肉瘤的风险。本研究细致描述了该新型突变位点肌瘤剔除术标本的临床病理特征，重点强调了平滑肌瘤内及瘤间FH缺陷形态学的异质性。对于结果存疑的病例，增加切片数量可能有助于明确诊断。

研究观察到，FH免疫组化染色联合2SC检测可提高FH缺陷诊断的敏感性。鉴于FH免疫组化单独检测的敏感性有限，且同一患者不同平滑肌瘤间染色模式异质性显著，研究人员对其额外价值提出质疑。因此，研究人员强调：对于具有FH缺陷形态学特征的年轻子宫肌瘤患者，即使FH免疫组化染色保留，也应考虑进行遗传咨询及基因检测。

参考文献：Wang L, Du R, Han L, Yang R, Li Y. A new missense mutation c.1240A>G in fumarate hydratase gene leads to uterine leiomyoma associated hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer (HLRCC) syndrome in Chinese. Transl Oncol. 2024 Jul;45:101963. doi: 10.1016/j.tranon.2024.101963. Epub 2024 Apr 25. PMID: 38663218; PMCID: PMC11063639.

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