标签蛋白纯化实战秘籍：His标签纯化小技巧

1、想要纯化一个蛋白，是否应立即开始纯化实验操作？

答：不用着急立刻实验，在实验开始前，应该先确定目标蛋白的性质，例如分子量，等电点，可溶性，稳定性等等，这些数据可以查找相关的文献或者Uniprot等蛋白数据库；

其次，还应该确定纯化目标，不同用途对于纯化的蛋白量，纯度，活性和均一性都有不同要求；

最后，还需要根据CIPP层析策略设计纯化方案，合理利用每个层析方法的特点，提高蛋白的纯度和减少蛋白蛋白损失。

2、一个完整的亲和层析实验包括哪些步骤？

答：亲和层析的实验步骤一般分为5个阶段，包括平衡、上样、洗杂、洗脱、再生。

3、His标签蛋白纯化结合缓冲液中也要加咪唑？

答：是的，我们建议您在结合缓冲液中也可以加入少量的咪唑（20-40mM），以减少杂蛋白的非特异性吸附。

4、如何提高His标签蛋白纯化的纯度？

答：可以尝试：

（1）使用线性洗脱的方式：500 mM咪唑，0%-100%线性梯度洗脱10 CV；

（2）在镍柱纯化之后增加离子交换和分子筛等步骤继续纯化；

（3）结合缓冲液中加入少量咪唑；

（4）其他考虑方向包括His标签蛋白被部分降解，优化结合和洗脱条件，尝试不同金属离子螯合的填料，构建双标签蛋白，添加去垢剂，还原剂等添加剂破坏杂质和目的蛋白间的相互作用等等

5、Ni Sepharose excel和Ni Sepharose HP、FF有什么区别，如何选择？

答：这3款填料都是Cytiva非常经典的His标签纯化产品，各有特点：

（1）HP（High Performance）

高性能，填料平均颗粒粒径约34 μm，更细的颗粒能带来更高分辨率的分离纯化。经过HP纯化后样品峰更窄，浓度高且收集体积小，节省了后续浓缩步骤的时间。

（2）FF（Fast Flow）

快流速，填料平均颗粒粒径约90 μm，具有良好的分辨率及轻松实现规模扩大的分离纯化，更适用于Batch/重力流下的蛋白纯化和多孔板筛选。

如果纯化包涵体蛋白较多，可以优先考虑FF或FF Crude（样品可无需过滤直接上样Crude预装柱，大大节省样品的前处理时间）。

（3）Ni Sepharose Excel

镍脱落极低，而且能耐受100 mM EDTA。适合真核分泌表达的蛋白，同时可以直接不脱镍进行碱洗。

6、Ni Sepharose FF、HP、Excel 应该如何清洁再生？

答：

（1）对于Ni Sepharose FF、HP：

•首先需要用20 mM sodium phosphate，500 mM NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4 脱镍；

•再按CIP protocols进行清洗（不脱镍直接上碱洗可能会产生棕色沉淀导致柱子堵塞）；

•脱镍后可以用0.5-1 M NaOH清洗+水洗，再用100 mM NiSO4挂镍；

•结束后先水洗，保存在20%乙醇中。

（2）对于Ni Sepharose Excel：

•无需脱镍可以直接用0.5-1 M NaOH进行清洗+水洗。