MeRIP-seq揭示m6A修饰在病毒感染中的免疫调控作用

人类呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是引起婴幼儿和老年人呼吸道感染的常见病原体，目前尚无特效药物。N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA上最常见的修饰之一，参与多种细胞过程和病理过程的调控，包括病毒感染。研究表明，m6A修饰在病毒感染过程中发生变化，可能影响宿主的抗病毒免疫反应。

近日，遵义市第一人民医院（遵义医科大学第三附属医院）呼吸内科李竹博士等为第一作者，贵州省人民医院刘代顺教授为通讯作者，在《iScience》杂志发表题为《The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus》的研究论文，探讨了m6A修饰在人类呼吸道合胞病毒（RSV）感染中的作用，特别是FTO（脂肪质量和肥胖相关蛋白）和GDF6（生长分化因子6）在调控宿主抗病毒免疫和炎症反应中的功能。研究发现，RSV感染导致宿主m6A修饰水平下降，FTO表达增加，而FTO通过调控GDF6的m6A修饰影响病毒复制和免疫反应。研究结果为开发靶向RSV感染的新疗法提供了潜在的分子靶点。

标题：The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus（GDF6-FTO轴调控对人类呼吸道合胞病毒的先天免疫和炎症反应）

发表时间：2024年10月18日

发表期刊：iScience

影响因子：IF5.8

技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq

研究亮点

l RSV感染促进去甲基化酶FTO增加：RSV感染导致去甲基化酶FTO的表达水平上升。

l FTO耗竭稳定了GDF6的mRNA：在FTO基因敲除的细胞中，GDF6的mRNA稳定性增强。

l 结合蛋白IGF2BP1缺失导致GDF6表达下降：IGF2BP1（胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1）的缺乏会降低GDF6的表达水平。

l FTO/GDF6轴改变I型干扰素和促炎因子：FTO和GDF6互作可调控I型干扰素和促炎细胞因子水平。

研究摘要

本研究通过MeRIP-seq和对应的RNA-seq分析，揭示了去甲基化酶FTO（脂肪质量和肥胖相关蛋白）耗竭能够稳定GDF6的mRNA，增强I型干扰素（I-IFN）水平，并降低促炎因子的表达，从而发挥抗病毒效应。此外结合蛋白IGF2BP1缺失会导致GDF6表达下降，进而减少I型干扰素产生。并进一步证实了RSV感染患者咽拭子样本中m6A水平的变化。总之，本研究结果表明，RSV感染能够诱导宿主m6A修饰水平变化，而FTO介导的m6A修饰通过促进GDF6 mRNA的稳定性和蛋白翻译，确保了抗病毒免疫反应进行。

FTO-GDF6轴、m6A修饰、抗病毒免疫和病毒复制之间关系机制图形摘要

研究方法

细胞实验：使用BEAS-2B（人支气管上皮细胞）进行RSV感染实验。

临床样本分析：收集RSV感染儿童的咽拭子样本，检测m6A修饰水平。

基因敲除和过表达：通过慢病毒载体构建FTO敲除和GDF6过表达的细胞模型。

m6A检测：使用m6A比色法、质谱（MS）分析、RNA斑点印迹等方法检测m6A修饰水平。

转录组测序（RNA-seq）和m6A免疫沉淀测序（MeRIP-seq）：分析RSV感染后m6A修饰的基因变化。

Western Blot：检测蛋白质表达水平。

小鼠模型：通过小鼠模型验证RSV感染的病理变化和FTO、GDF6的功能及qPCR验证。

结果图形

（1）RSV感染与低水平m6A mRNA甲基化相关

RSV感染后，BEAS-2B细胞和儿童咽拭子样本中的m6A修饰水平显著下降，且这种下降与FTO表达增加相关。这表明FTO可能在RSV感染过程中起主要作用。

图1：RSV感染期间m6A表达下调，与FTO水平升高一致。

(A) m6A比色法检测BEAS-2B细胞在RSV感染24h后的mRNA m6A修饰整体水平。

(B) m6A比色法检测BEAS-2B细胞在400TCID50/mL RSV感染后不同时间点的m6A水平。

(C) LC-MS量分析BEAS-2B细胞在400TCID50/mL RSV感染24h后的m6A丰度。

(D) m6A比色法定量分析咽拭子样本中总RNA的m6A含量（每组n=16）。

(E) RSV感染24h后BEAS-2B细胞RNA水平的斑点印迹分析。

(F) qPCR分析BEAS-2B细胞在RSV感染24h后的m6A调控因子表达。

(G) GSE3397数据集的m6A调控因子热图。

(H-J) Western blot分析BEAS-2B细胞在RSV感染后RSV-F和FTO的蛋白表达。

(K) qPCR分析咽拭子样本中FTO的表达。

(L) m6A修饰与FTO表达之间的相关性分析。

（2）RSV感染抑制细胞增殖，激活先天免疫，并促进炎症细胞因子释放

RSV感染抑制了BEAS-2B细胞的增殖，并显著增加了炎症细胞因子（如IL-1、IL-6）和I型干扰素（IFN-α、IFN-β）的表达，激活了宿主的先天免疫反应。

图2：RSV感染抑制细胞增殖，激活先天免疫，并促进炎症细胞因子释放

(A) 在RSV感染后不同时间点，TCID50法检测HEp-2细胞中的RSV病毒滴度。

(B) 在RSV感染后不同时间点，CCK-8实验分析BEAS-2B细胞的增殖情况。

(C-H) RSV感染24小时后BEAS-2B细胞的qPCR分析。

(I-O) RSV感染24小时后BEAS-2B细胞中RSV-G、TLR7、MyD88、RIG-I和IL-6蛋白水平的Western blot分析。

（3）体外实验中FTO对抗病毒免疫是必需的

FTO基因敲除的BEAS-2B细胞中，I型干扰素和抗病毒基因的表达显著增加，而炎症细胞因子的表达减少，表明FTO在调节抗病毒免疫中起关键作用。

图3：体外实验中FTO对抗病毒免疫是必需的。

(A) 使用慢病毒载体建立FTO基因敲除的稳定细胞系。

(B-C) 对照组和FTO基因敲除BEAS-2B细胞的RNA-seq结果进行GO和KEGG分析。

(D) FTO基因敲除组TNF信号通路和炎症反应转录特征的双尾基因集富集分析。

(F) 炎症细胞因子和干扰素相关基因的表达变化倍数。

(G-L) 在RSV感染24h后，对照组和FTO基因敲除的BEAS-2B细胞的qPCR分析。

（4）FTO调节病毒复制和炎症反应

FTO基因敲除的细胞中，RSV复制减少，I型干扰素和炎症细胞因子表达变化，表明FTO对RSV复制和炎症反应有重要作用。

图4：FTO调控病毒复制和炎症反应

(A) m6A比色法分析FTO基因敲除细胞中mRNA m6A修饰的总体水平。

(B) CCK-8实验分析RSV感染期间不同时间点FTO基因敲除细胞的细胞增殖情况。

(C) TCID50法检测400 TCID50 RSV感染后FTO基因敲除细胞中RSV的病毒滴度。

(D-E) 在RSV感染24h后，对照组和FTO基因敲除的BEAS-2B细胞的qPCR分析。

(F) 在RSV感染24h后，FTO基因敲除BEAS-2B细胞中RSV-G和RSV-F蛋白水平的Western blot分析。

(G-J) 在RSV感染24h后，对照组和FTO过表达的BEAS-2B细胞的qPCR分析。

（5）GDF6是FTO的直接靶标

通过MeRIP-seq和RNA-seq分析，发现GDF6是FTO的潜在靶基因，FTO通过m6A修饰调节GDF6的mRNA稳定性和蛋白表达。

图5：通过MeRIP-seq和RNA-seq鉴定FTO靶标。

(A) 在RSV感染的BEAS-2B细胞中，MeRIP-seq检测到主要的共有序列"RRACH"。

(B) m6A peaks在mRNA转录本上的密度分布。

(C) 与对照组相比，KEGG富集分析与RSV感染的BEAS-2B细胞中的m6A修饰相关。

(D) RNA-seq鉴定出在有或没有FTO基因敲除的BEAS-2B细胞中上调或下调的基因。

(E-F) 筛选出在MeRIP-seq中下调且在RNA-seq中上调的共有基因。

(G) 在RSV感染或未感染的BEAS-2B细胞中进行24小时qPCR分析。

(H) 在有或没有FTO基因敲除的RSV感染BEAS-2B细胞中进行qPCR分析。

(I) 在咽拭子样本中对GDF6进行实时定量PCR（qPCR）分析。

(J-K) 在有或没有FTO基因敲除的RSV感染BEAS-2B细胞中对GDF6进行西方印迹（Western blot）分析。

（6）体外实验中GDF6减少病毒复制和RSV诱导的炎症反应

GDF6过表达的BEAS-2B细胞中，RSV复制减少，炎症细胞因子的表达降低，而I型干扰素的表达增加，表明GDF6在抗病毒免疫中起重要作用。

图6：GDF6通过MyD88机制在体外减轻炎症反应

(A-B) 在GDF6过表达的BEAS-2B细胞中，对GDF6进行qPCR和Western blot分析。

(C-D) GDF6过表达的RSV感染BEAS-2B细胞中的RSV-G进行qPCR和Western blot分析。

(E) 在400 TCID50 RSV感染后，通过TCID50法检测GDF6过表达细胞中RSV的病毒滴度。

(F-J) 在GDF6过表达的RSV感染BEAS-2B细胞中，对IL-1、IL-6、IFN-α1和IFN-β1进行qPCR分析。

(K) GDF6过表达的RSV感染BEAS-2B细胞的MyD88和IL-6进行Western blot分析。

（7）鉴定GDF6为潜在的m6A修饰基因

通过SRAMP平台预测和m6A RIP-PCR验证，发现GDF6 mRNA上存在多个m6A修饰位点，这些位点影响GDF6表达。

图7：m6A修饰影响GDF6的表达

(A) SRAMP平台预测GDF6的m6A位点。

(B-C) 在BEAS-2B细胞中验证m6A抗体与GDF6-424和GDF6-1199 mRNA之间的直接结合。

(D-E) 在FTO基因敲除的BEAS-2B细胞中，通过MeRIP-qPCR验证m6A抗体和GDF6-424以及GDF6-1199 mRNA的相对富集情况。

(F-G) 在BEAS-2B细胞中，经过有或没有DAA（3-脱氮腺苷）处理后，qPCR确定GDF6 mRNA的相对表达量。

(H-J) 在FTO基因敲除细胞中，经过有或没有DAA处理后，通过Western blot分析确定GDF6蛋白的相对表达量。

（8）FTO通过IGF2BP1介导m6A修饰调节GDF6 mRNA稳定性

FTO通过m6A修饰和IGF2BP1调节GDF6 mRNA的稳定性，影响GDF6的蛋白表达。

图8 通过m6A reader IGF2BP1，FTO介导的m6A修饰调节GDF6 mRNA。

(A) GDF6-424/1199的野生型或突变型（A-to-T突变）m6A位点。

(B) 在FTO基因敲除的BEAS-2B细胞中，测定GDF6-WT（野生型）和GDF6-Mut（突变型）的相对荧光素酶活性。

(C) 有或没有RSV感染的BEAS-2B细胞经放线菌素D处理后检测GDF6 mRNA衰减率。

(D) 在FTO基因敲除且RSV感染的细胞中给予放线菌素D处理后检测GDF6 mRNA衰减率。

(E-G) 使用siRNA在BEAS-2B细胞中通过qPCR分析IGF2BP1-3 mRNA的相对表达量。

(H) FTO基因敲除的BEAS-2B细胞经si-IGF2BP1-3后GDF6 mRNA的相对表达量qPCR分析。

(I-J) 在FTO基因敲除的BEAS-2B细胞中，使用si-IGF2BP1-3后，通过Western blot分析检测GDF6蛋白的相对表达量。

（9）体外实验中GDF6对抗病毒免疫是必需的

在GDF6基因敲除的BEAS-2B细胞中，分析结果揭示RSV复制增加，I型干扰素表达减少，表明GDF6在抗病毒免疫中发挥重要作用。

图9：GDF6在体外实验中对抗病毒免疫是必需的

(A) 在BEAS-2B细胞中，使用siRNA通过qPCR分析GDF6 mRNA的相对表达量。

(B-D) 在FTO基因敲除的BEAS-2B细胞中，使用si-GDF6后，qPCR分析RSV-N、IFN-α1和IFN-β1 mRNA的相对表达量。

易小结

本研究揭示了m6A修饰在RSV感染中的重要作用，特别是FTO和GDF6在调节宿主抗病毒免疫和炎症反应中的功能。这些发现为开发针对RSV感染的新疗法提供了潜在的分子靶点。

当然，研究可能存在一些局限性，如样本量有限、缺乏GDF6定位分析、缺少GDF6与FTO的相互作用域分析等。后续的研究方向或许可以在此基础上进行拓展性分析。

m6A MeRIP-seq在本研究中的重要作用

m6A MeRIP-seq技术在本研究中用于鉴定RSV感染后m6A修饰的基因变化，特别是确定了GDF6作为FTO的直接靶基因。通过m6A MeRIP-seq，研究人员能够精确地定位m6A修饰位点，并分析其对基因表达的影响，为理解m6A修饰在病毒感染中的作用提供了重要工具。

参考文献：

Li Z, Zhang L, Liu Y, Li H, Gong L, Tan X, Tian J, Pi H, Wang B, Zhao Y, Liu D. The GDF6-FTO axis modulates the innate immune and inflammatory response to human respiratory syncytial virus. iScience. 2024 Oct 18;27(10):111038.doi: 10.1016/j.isci.2024.111038.

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