WB实验心得：磷酸化抗体使用要点与避坑指南

在小优的研究生生涯中，她不断听到周围人对WB实验失败的抱怨声，这些声音如同背景音乐般伴随她度过了整个研究生涯。尽管WB实验让她遭遇了无数次挫折，但就像凤凰涅槃、浴火重生一样，小优从中学到了如何正确地面对失败的生活哲学。而在学习如何正确面对失败的同时，我们也应当掌握避免失败的方法。今天，小优想与大家分享在使用磷酸化抗体进行WB实验时应注意的一些要点。

1、警惕内部敌人： 在lysis buffer中必须加入蛋白酶抑制剂和适量的磷酸酶抑制剂，因为组织或细胞裂解过程中会释放大量的内源性蛋白磷酸酶，它们会催化磷酸化蛋白(R-p)去磷酸化，导致与正常生理状态不符的差异。因此，通过外源性添加蛋白磷酸酶抑制剂来抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，保持蛋白质的磷酸化状态至关重要，否则即使成功显现出band，结果也不可信。

2.低温能让他们紧紧地拥抱对方： 加入一抗后最好在4度下过夜，因为低温可以使抗体与目的蛋白紧密结合。由于蛋白抗原在膜上是靠物理吸附固定的，高温下容易脱落，从而降低结合效率。而且，4度下可以使一抗重复使用多次。考虑到磷酸化的抗体通常价格不菲，而磷酸化蛋白只占总蛋白量的极小部分，像联谊舞会上让来宾多相处一会以增加形成couple的概率那样，过夜可以保证抗体和蛋白有充足的结合时间。至于二抗，室温下1小时即可。

3.他们不宜"喝奶"： 建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，而非常见的含5%non-fat milk的TBST。因为脱脂奶中含有磷酸化蛋白丰富，是奶中磷元素的来源之一。

4.如何避免磷化蛋白君和总蛋白君在膜上"打架"？ 研究完某一蛋白的磷酸化情况后，通常也需要研究该蛋白的总表达量。但由于两者的条带位置相同，怎么办？可以在压完磷酸化抗体后，将相同的membrane做strip处理后再压总蛋白抗体，然后再次strip，最后再压内标actin。

5.听marker的，没错： 在进行磷酸化蛋白WB实验时，除了目标蛋白的band外，通常还会出现非特异性的band。如果使用的磷酸化抗体质量不佳，甚至可能只压出非特异性的band而没有想要的band，因此在压片后，一定要根据markers比对，确认你得到的band分子量是否正确。

6.洗涤也大有学问： 洗涤对最终的背景影响也很大。millipore最近的说明书推荐使用双蒸水洗涤，效果显著。具体操作如下：1st和2nd抗体之间，使用DDW洗涤5分钟×3次；2nd抗体后，DDW洗涤5分钟×3次，TBST洗涤5分钟×1次，然后用DDW rinse 3-4次。相比使用TBST洗涤的membrane，此方法能有效降低背景，即使压片30分钟，背景仍然可以忽略不计。