Western Blot：小实验里的 “大江湖”

Western Blot（蛋白印迹），作为科研日常最基础的实验之一，看似流程常规，实则藏着无数细节 -- 堪称 "小实验里的大文章"。相信多数科研人初涉此 "江湖" 时，都被折腾得 "体无完肤"，但在与 WB 反复 "过招" 中，也攒下了不少实战经验。

前人栽树，后人乘凉！小备整理了许多 WB 实验心法，助力大家少踩坑、高效出结果 👇

一、蛋白提取：基础中的基础

蛋白提取是 WB 的 "第一关"，裂解液选择、样本处理稍有差池，后续全白搭。

1. 裂解液的 "门道"

不同裂解液适配不同需求，常见类型及特点如下（按需选择更高效）：

Tips：

• 无论哪种裂解液，蛋白酶 / 磷酸酶抑制剂必加（防止蛋白降解、去磷酸化）；

• 若裂解后悬液仍有不溶物，可辅助 10 - 20s 超声破碎（需冰浴，避免产热）；

• 紧急情况下，可用 1×SDS Loading Buffer 替代裂解液（效果类似 SDS 裂解液，但无法测浓度）。

2. 干扰蛋白的 "围剿"

细胞 / 组织样本中，血清残留的 白蛋白（~70kDa）、免疫球蛋白（~50kDa） 是常见 "杂带元凶"-- 即使抗体不直接识别它们，高浓度蛋白也会因非特异吸附造成信号富集，形成杂带。

应对策略：

• 细胞样本：用 PBS 漂洗至少 3 次（彻底去除培养基残留）；

• 组织样本：尽量清理血液残留（如心脏组织剪去血块、用 PBS 冲洗），从源头减少干扰。

二、胶浓度与电泳：让蛋白 "各就各位"

选对凝胶浓度和电泳条件，能让目的蛋白 "精准分离"，减少杂带干扰，让条带更清晰。

凝胶浓度 & 电泳条件速查表（按蛋白分子量选择）

核心逻辑：小分子量蛋白用高浓度胶 "限制迁移"，大分子量蛋白用低浓度胶 "拓宽通道"，电泳电压梯度控制可避免条带 "挤压" 或 "拖尾"。

三、转膜：把蛋白 "搬" 到膜上

转膜是 WB 的 "技术活"-- 膜与胶的贴合度、电压 / 时间控制、正负极方向，稍有差错就会前功尽弃。

1. 转膜条件（按蛋白分子量调整）

2. 转膜操作 "避坑指南"

• 膜与胶的匹配：PVDF 膜大小需 与凝胶一致或略小（避免蛋白 "跑" 到膜外），滤纸、海绵尺寸同步匹配；

• "三明治" 结构：胶→膜→滤纸→海绵的顺序不能乱，厚度要均匀（太厚易让胶变形、条带弯曲；太薄易进气泡、条带残缺，可通过增减滤纸调整）；

• 正负极别搞反：蛋白带负电，从负极（胶侧）向正极（膜侧）转移，接反直接 "翻车"；

• 全程冰浴：转膜缓冲液提前预冷，过程中保持低温（防止蛋白变性、转膜效率下降）。

总结：WB 实验看似流程固定，实则每个环节都藏着 "细节密码"-- 从裂解液选择到转膜操作，每一步都影响最终结果。

四、分子量 "预测值" 与 "实际值" 的差异解析

WB 实验中，目的蛋白条带位置与预测分子量不符是常见 "小插曲"。这并非实验失败，而是蛋白本身特性、实验工具误差等多重因素共同作用的结果。以下拆解核心影响因素，帮你精准定位 "差异原因" 👇

一、预染 Marker 的 "天然误差"：

预染 Marker 是 标准蛋白 + 有色染料 偶联的产物，但偶联过程会改变蛋白表面结构，导致其在 SDS-PAGE 中的迁移率与天然蛋白存在偏差；且不同批次偶联的染料量、蛋白构象有细微差异，最终表现为 5 - 10% 的分子量误差（无法完全避免）。

应对：若需精准分子量，改用 非预染 Marker 标定（天然蛋白无偶联干扰，迁移率更稳定）。

二、物种差异：同源蛋白 "长度不同"：

人源、大鼠源、小鼠源的同源蛋白，氨基酸序列并非 100% 一致 -- 部分蛋白会因物种进化出现 "长度差异"，直接导致分子量预测值与实际值不符。

示例：某些肿瘤相关蛋白（如特定转录因子），小鼠源与人类源的氨基酸序列长度差 10 - 20 个残基，分子量差异可达 2 - 3kDa。

应对：查询蛋白数据库（如 Uniprot）时，需 严格筛选物种来源，确保预测值与实验样本匹配。

三、蛋白自身特性："动态变化" 的分子量：

蛋白并非静态分子，翻译后修饰、剪切加工、亚型差异等，都会让分子量 "灵活变动"-- 这是导致差异的最核心因素！

1. 翻译后修饰：分子量 "变大"：

磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰，会给蛋白 "额外增重"：

• 糖基化：CD 家族蛋白（如 CD44）经糖基化修饰后，分子量可从理论值（~37kDa）飙升至 80 - 100kDa；

• 磷酸化：信号通路蛋白（如 p-ERK）磷酸化后，分子量会因带电基团增加，迁移率变慢（条带偏上）。

2. 剪切加工：分子量 "变小"：

部分蛋白以 酶原形式（前体） 合成，经剪切激活后分子量降低：

• 示例：MMP2 蛋白，酶原（pro-MMP2）分子量～72kDa，激活后剪切为～63kDa 的活性形式。

3. 亚型 / 转录本差异：分子量 "多样"：

一个基因可编码 多个转录本 / 亚型，翻译后蛋白分子量不同：

• 示例：JNK 蛋白分 JNK1、JNK2、JNK3 亚型，每个亚型又有不同转录本（如 JNK1 存在 46kDa、54kDa 两种形式），同源性高但分子量有差异。

四、Uniprot：分子量 "预测的权威参考"：

Uniprot 数据库是蛋白研究的 "百科全书"，可查询：

• 蛋白 理论分子量、亚型分类、转录本种类；

• 最初发现文献、翻译后修饰位点、剪切加工信息。

总结：分子量 "预测值" 与 "实际值" 的差异，本质是蛋白 "动态特性" 与实验工具 "固有误差" 共同作用的结果。遇到差异别慌，从 Marker 类型、物种来源、蛋白修饰 / 剪切 / 亚型 三个维度排查，结合 Uniprot 数据库验证，就能精准解析原因。

五、"白板" 与 "黑板"：WB 结果的 "跷跷板" 困境

WB 实验最让人纠结的，莫过于结果卡在 "白板"（啥信号没有）和 "黑板"（背景糊成一片）之间。本质上，这是 "检测条件不足" vs "检测条件过量" 的博弈，以下拆解核心原因与应对策略 👇

一、白板："信号不足" 的连锁反应

"白板"≠实验失败，而是某些条件没到位，导致信号无法被检测到。从样本、抗体、孵育、显色 四个维度排查：

1. 样本浓度：基础中的基础：

WB 对蛋白浓度有最低要求 -- 每孔需 20 - 40μg 总蛋白（细胞样本建议浓度 ≥1μg/μL，组织样本因复杂成分需更高浓度）。

应对：

• 用 BCA 法重新定量，确认样本浓度是否达标；

• 若浓度低，可通过 "浓缩样本"（如超滤管浓缩）或 "增加上样体积"（但别超过孔容量）解决。

2. 一抗稀释比例：别死磕说明书：

说明书推荐的一抗比例（1:500 - 1:2000）是 "通用值"，但实际效果受样本丰度、抗体批次影响。

应对：

• 若按最低比例（1:500）仍白板，优先排查其他环节（如样本、转膜）；

• 若比例过高（如 1:5000），可尝试 梯度稀释优化（如 1:500、1:1000、1:2000 对比）。

3. 一抗孵育时间：给抗体 "足够反应时间"：

常规条件是 4℃ 过夜（12 - 16h），但部分抗体亲和力低，需延长孵育 "唤醒信号"：

进阶策略：

• 延长时间（4℃ 缓慢孵育，让抗体充分结合）；

• 或 4℃ 摇床低速孵育（增加抗体与膜的接触概率）；

• 👉 不建议 37℃ 孵育（易导致非特异结合，且加速抗体降解）。

4. 显色体系：灵敏度决定 "信号下限"：

ECL 化学发光的灵敏度 比 DAB 高 5 - 10 倍，优先选 ECL；且 ECL 发光液分 普通型、灵敏型、超灵敏型，信号差异显著：

优化思路：

• 低丰度蛋白→选超灵敏型 ECL；

• 常规样本→用灵敏型即可；

• 同时，延长曝光时间（从 30s 到数分钟梯度尝试），捕捉弱信号。

二、黑板："信号过量" 的背景灾难

"黑板" 是信号过强或非特异结合过多，导致背景淹没目的条带。核心解决思路是 "减量化"：

1. 上样量：别让蛋白 "堆成山"：

上样量过高（如总蛋白＞50μg / 孔），会导致膜上蛋白过度密集，非特异结合暴增。

应对：

• 降低上样量（如从 40μg 减到 20μg）；

• 或稀释样本后重新上样。

2. 抗体比例：一抗、二抗 "降浓度"：

• 一抗：若原比例是 1:500，可尝试 1:1000、1:2000 梯度稀释；

• 二抗：虽成熟，但高浓度仍会增加背景。建议用 1:5000 - 1:10000（HRP 二抗常温孵育 30 - 60min 即可）。

3. 曝光时间：别让背景 "喧宾夺主"：

曝光时间过长（如＞5min），背景杂带会随目的条带一起被强化。

应对：

• 缩短曝光时间（从 30s 开始梯度尝试，找到 "目的条带清晰、背景干净" 的临界点）；

• 配合 预染 Marker 定位目的条带位置，针对性缩短曝光。

六、封闭液：WB 的 "背景调节器"

封闭的核心是阻断膜上非特异结合位点，常规用 5% 脱脂奶粉（溶于 1×TBST），常温摇床封闭 1h。但遇到特殊情况，可换用 0.5% 明胶，两者差异及选择逻辑：



进阶技巧：

• 若单一封闭液效果差，可尝试 混合封闭（如 3% 脱脂奶粉 + 0.2% 明胶）；

• 封闭时间可延长至 2h（尤其样本复杂时，给封闭液足够时间覆盖非特异位点）。

总结：WB 实验的 "白板" 与 "黑板"，本质是检测条件的 "过犹不及"。遇到白板，从样本浓度、抗体比例、孵育时间、显色灵敏度 逐步优化；遇到黑板，通过降低上样量、稀释抗体、缩短曝光 减少背景。封闭液则是 "背景调节器"，灵活切换脱脂奶粉和明胶，能解决很多疑难问题。

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