国自然热点：热度攀升的外泌体研究​

自 2013 年外泌体相关研究者摘得诺贝尔生理或医学奖，外泌体研究便持续成为国自然热点，中标项目占比连年走高。2022 年，外泌体中标项目数跻身国自然热点前五；2023 年，其中标数依旧高位盘踞，国自然资助金额超 2 亿 。

外泌体究竟有何独特魅力？一起来探索：

外泌体概览

外泌体（Exosomes）是直径约 40 - 160nm 的小泡结构，由细胞经外胞吞作用释放至胞外环境。从血液、尿液，到唾液、乳汁，乃至体外培养细胞的上清液，几乎各类生物体液中都有它们的身影 。外泌体可携带蛋白质、脂质、RNA、DNA 等多种生物分子，在免疫调控、组织修复、遗传信息传递等生理过程里，扮演着重要 "信使" 角色。

外泌体研究聚焦方向

近年外泌体研究项目，聚焦以下领域：

1. 功能机制探究

外泌体作为细胞间通讯的 "载体"，与疾病发生发展深度关联。挖掘其生物学功能与作用机制，对解码疾病进程意义重大。当前，机制研究多聚焦肿瘤、心血管、神经、免疫四大方向，试图解析外泌体在疾病起源、进展中的分子逻辑 。

2. 工程化外泌体开发

通过修饰、改造外泌体，让其适配临床需求，比如赋予靶向递送药物的能力，成为精准医疗新路径。经工程化设计后，外泌体可突破生物屏障，定向将治疗分子输送至病变位点，为难治愈疾病提供新策略 。

3. 体外诊断标志物挖掘

凭借体液中广泛存在的特性，外泌体成为非侵入性疾病诊断的 "潜力股"。在癌症、心血管病、神经退行性疾病等领域，外泌体作为生物标志物，已展现出早期诊断的巨大价值，有望革新疾病筛查与诊断模式 。

下面为大家梳理外泌体研究中提取→鉴定→标记→保存这一经典实验思路，助力开启外泌体探索之旅 。

提取

外泌体研究的起始关键步骤，是从样本里提取外泌体。当下存在多种提取手段，不过每种方法都有其优势与不足，实际操作时，常需搭配组合不同方法，以此获取高纯度、高浓度的外泌体 。

外泌体鉴定

完成外泌体提取后，需开展鉴定工作。国际细胞外囊泡学会发布的指导手册，从以下三个核心维度对鉴定流程进行规范，为外泌体研究提供权威指引：

一、TEM 形态鉴定

外泌体的典型特征是具备双层囊泡结构，普通光学显微镜因分辨率限制无法识别。透射电镜（TEM） 可直接观察外泌体的形态、结构完整性，凭借对囊泡超微结构的精准呈现，成为外泌体形态鉴定的 "金标准" 。

二、NTA 理化特性检测

尽管 TEM 能直观呈现外泌体形态，但无法全面覆盖样本中所有囊泡的大小与浓度信息。纳米颗粒追踪分析（NTA） 可快速测定外泌体的粒径分布与浓度，通过动态追踪纳米颗粒布朗运动，量化反映群体特征，是外泌体理化特性鉴定的关键指标 。

三、WB 标志蛋白验证

除形态与理化特性，外泌体的标志蛋白检测同样重要。常用标志物涵盖两类：一是跨膜蛋白（如 CD63、CD9、CD81 ），二是膜结合 / 游离蛋白（如 TSG101、Alix、HSP70 ）。实验中需至少检测 2 种标志蛋白 ，最经典组合为 CD63 与 TSG101 ，通过免疫印迹（WB）验证蛋白表达，进一步锚定外泌体身份 。

四、文献实践案例

在探究心外膜脂肪来源细胞外囊泡（eFat-EVs）参与房颤（AF）发病机制的研究中，通过超速离心分离 AF 患者与非 AF 患者的 eFat-EVs 后，依次开展：

• NTA 检测：明确 EVs 粒径分布与浓度；

• TEM 观察：确认典型囊泡形态；

• WB 验证：检测 CD63、TSG101、CD81 标志蛋白。结果均符合外泌体特征。



外泌体标记与示踪技术

获取外泌体后，为深入探索其在体外或体内的功能机制，通常需对其进行标记。当前以荧光染料为主，核心包括 Di 系列、PKH 系列及膜渗透性染料，以下展开说明：

一、Di 系列染料标记体系

DiO/DiI/DiD/DiR 均为常用的亲脂性荧光染料，通过嵌入外泌体膜脂双层实现标记，其特性差异如下：

• DiR作为近红外荧光染料，兼具体外标记与活体成像优势，可穿透组织深层并减少背景干扰，是体内示踪的优选工具。

二、PKH 系列染料标记技术

PKH 系列染料以PKH26和PKH67最为常用，二者通过与外泌体膜蛋白共价结合实现稳定标记，光谱特性差异如下：

• PKH26：发射红色荧光（Ex/Em=551/567nm），标记后荧光信号持久稳定，适用于长期追踪；

• PKH67：发射绿色荧光（Ex/Em=490/504nm），荧光强度高且对细胞毒性低，适合短期动态观察。实验中可根据荧光检测设备波长、追踪时长等需求灵活选择。

技术优势延伸

PKH 染料的标记机制使其具备两大核心优势：①与膜蛋白的共价结合可避免染料快速代谢流失，适合长时间示踪；②标记过程不影响外泌体膜结构及生物活性，保障功能研究的真实性。相较于 Di 系列染料，PKH 系列更适用于需要维持外泌体完整性的体外共培养或长期体内追踪实验。

三、CFSE 标记技术在体外泌体示踪中的应用

CFSE（羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）作为跨膜荧光探针，凭借其膜渗透性与绿色荧光特性（Ex/Em=492/517nm），成为外泌体体外示踪的常用工具。其标记机制为：CFSE 进入外泌体后，被酯酶水解生成带负电荷的荧光分子，从而保留在囊泡内实现稳定标记。

技术特性延伸：

CFSE 标记具备三大优势：①膜渗透性强，无需复杂操作即可进入外泌体；②荧光信号稳定，适用于短期体外动态追踪（如细胞摄取、功能干预实验）；③与流式细胞术兼容，可实现单细胞水平的定量分析。但需注意，CFSE 在长期体内追踪中可能因外泌体降解导致信号衰减，更适合体外或短期体内实验场景。

外泌体保存技术规范与实践

获取外泌体后，理想状态是立即开展后续实验。但受样本量、实验排期等因素影响，常需对未使用外泌体进行保存。科学的保存条件是维持外泌体活性与结构完整的关键，以下按保存时长分类说明：

一、短暂保存策略（短期使用场景）

保存条件：

• 温度：4℃冷藏保存

• 核心目的：避免冻融循环对囊泡膜的损伤

技术局限性：

4℃环境下外泌体稳定性有限，研究表明：保存 1 个月后，外泌体表面标志蛋白（如 CD63、TSG101）几乎完全降解。这是由于 4℃条件下，外泌体携带的蛋白酶仍具有活性，持续降解膜蛋白与内容物，导致功能丧失。

二、长期保存标准（≥1 个月或批量储存）

操作流程：

• 分装处理：将外泌体按实验用量（如 50-100μL / 管）分装至冻存管

• 冻存条件：-80℃超低温冰箱储存

关键技术要点：

• 避免反复冻融：分装的核心目的是减少冻融次数。研究证实，反复冻融（如 3 次以上）会显著降低标志蛋白表达水平，推测与囊泡膜脂质双分子层破坏、内容物泄露相关。

• 辅助保护措施：可在保存液中添加 10% 胎牛血清（FBS）或 10% 二甲基亚砜（DMSO），通过稳定膜结构提升保存稳定性。

注：从 4℃转移至 - 80℃保存时，建议采用梯度降温（如先置于 - 20℃ 1 小时），减少冰晶形成对囊泡的物理损伤。