IFNγ表达与CTL中增强的细胞毒性之间的关系

CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）通过释放大量IFNγ和颗粒酶，作为连续杀手清除受感染或恶性病变的细胞。尽管IFNγ是一种具有多种免疫调节功能的多效性细胞因子，但其在CTL介导的细胞毒性中的精确时空调控及其作用仍未完全明确。这里，德国萨尔大学团队，利用野生型（WT）和颗粒酶B-mTFP敲入小鼠，结合体外实验方法，包括T细胞分离与培养、包被抗CD3e抗体刺激、脱颗粒检测、流式细胞术、免疫荧光以及结构照明显微镜技术，以研究CTLs中IFNγ的动态变化。CTLs中的IFNγ表达迅速、短暂，并且严格依赖于TCR激活。鉴定出两个功能不同的产生IFNγ的亚群：IFNγhigh（IFNγhi）和IFNγlow（IFNγlo）CTLs。与IFNγlo CTLs相比，IFNγhi CTLs表现出效应/效应记忆表型，其CD107a表面表达显著升高（溶细胞性颗粒胞吐的标志），并且与cis-Golgi和颗粒酶B的共定位更加明显。此外，在初始CTLs中，早期激活标志物CRTAM与IFNγ表达相关。研究结果建立了高水平IFNγ产生与CTL增强的细胞毒性之间的联系，表明CRTAM可能是调控早期CTL激活和IFNγ诱导的潜在因子。这些发现为优化针对感染和癌症的T细胞免疫治疗策略提供了理论基础。

CTLs是保护宿主免受感染和恶性病变的重要免疫卫士。当初始CD8+T细胞（TN）通过特异性APCs识别抗原后，会发生克隆扩增，并分化为短寿命的效应CTLs（TE），这些细胞会迁移至外周组织和炎症部位。大多数TE在收缩期发生凋亡，而一小部分则持续存在，形成长寿命的记忆T细胞（TM）。这些记忆群体至少包含两个不同的亚群：中央记忆性（TCM）和效应记忆性（TEM）T细胞。在小鼠中，短寿命的TE会下调CD62L，但仍保留部分IL-7Rα（CD127）的表达，而长寿命的TM则组成性地表达CD127。TCM高表达CD62L，而TEM则下调CD62L。值得注意的是，在慢性感染或癌症情况下，持续的抗原暴露可使初始T细胞进入一种称为T细胞耗竭（TEX）的功能障碍状态。理解CTL亚群的异质性和功能对于阐明各种疾病中免疫应答的复杂动态至关重要。

CTLs通过裂解性（lytic）（颗粒酶和穿孔素）和非裂解性（non-lytic）（IFNγ和TNFα）机制清除靶细胞。其效应功能受到如T-bet、Eomes、CRTAM（Class-I MHC限制性T细胞相关分子）、T-box以及Runx家族蛋白等转录因子的调控。CTL的杀伤能力依赖于细胞毒性颗粒（CGs）及其脱颗粒效率。CGs是含有颗粒酶和穿孔素的分泌型溶酶体（SGs），由包含溶酶体相关膜糖蛋白（LAMPs）的脂双层包裹，其中包括CD107a（LAMP-1）、CD107b（LAMP-2）和CD63（LAMP-3）。当识别到靶标时，CGs会与质膜融合，并通过胞吐作用释放其细胞毒性物质。由于静息状态的CTL表面缺乏LAMPs，CD107a/b的表达可作为脱颗粒程度的定量标志。此外，储存在特异性SGs中的Fas配体（FasL/CD95L）在脱颗粒过程中被释放到细胞外，以诱导靶细胞发生凋亡。有趣的是，CTL本身也表达Fas受体（Fas），从而具备自相残杀的能力（CTL-fratricide），这一机制在免疫应答收缩期有助于清除效应T细胞。

除了直接的细胞毒性外，CTLs还通过分泌IFNγ和TNFα来发挥效应功能。IFNγ主要由NK细胞、Th1细胞和CD8+ T细胞产生。在小鼠结核分枝杆菌感染模型中，CD4+和CD8+ T细胞是体内IFNγ的主要来源。IFNγ是一种具有多种功能的细胞因子，具有双重作用--它既能表现出抗病毒和抗肿瘤活性，又在某些情况下反而促进肿瘤进展。从机制上讲，IFNγ信号传导可上调IRF-1，从而增强MHC-I/II的表达，使靶细胞更易受到CTL攻击。作为一种促炎细胞因子，IFNγ还能激活巨噬细胞分泌TNFα和IL-6。

在这里，调查了表达IFNγ的CTLs中的IFNγ产生、亚细胞定位、细胞亚型以及细胞毒性功能。发现，初始CD8+ T细胞在TCR激活后2h内迅速获得产生IFNγ的能力，而GzmB的表达则局限于具有成熟免疫突触的效应CTLs。活化的CTLs表现出短暂且依赖TCR的IFNγ表达，这与静息CTLs中预先储存的GzmB形成对比。令人惊讶的是，IFNγ+ CTLs分为IFNγhi和IFNγlo两个亚群，而GzmB+ CTLs则具有同质性。IFNγhi细胞表现出TE/TEM表型（低CD62L），而IFNγlo细胞则类似于TCM（高CD62L）。脱颗粒实验显示，IFNγhi CTLs的表面CD107a水平显著高于IFNγlo细胞，表明其裂解活性更强。此外，IFNγhi CTLs显示出与cis-Golgi和GzmB+囊泡的高度共定位，进一步支持了IFNγ表达与细胞毒性之间的联系。最后，对初始与活化CD8+ T细胞中IFNγ和CRTAM表达的比较分析提示，CRTAM可能调控早期T细胞活化和IFNγ的产生。

短暂的IFNγ表达依赖于静息CTLs中TCR的再次激活

为了确定IFNγ在活化的CTLs中是组成性表达还是受调控表达，按照之前报道的方法分析了TCR再次刺激后细胞内IFNγ的动态变化。第3-5天活化的CTLs，无论是否再次刺激，均被固定并透化处理（BD Cytofix/Cytoperm™试剂），然后用IFNγ-Alexa488和GzmB-Alexa647进行染色（不抑制高尔基体转运）。

在TCR再次刺激4h的图中显示了表达IFNγ和GzmB的CTLs（图1A,B）。在未受刺激的CTLs中，IFNγ几乎检测不到，但在TCR再刺激后其表达迅速升高（图1A）。而GzmB在再刺激前已有大量存在，并且在TCR再刺激后变化较小（图1B）。CTLs中IFNγ和GzmB的表达水平呈现出成熟依赖性的模式及不同的动力学特征。IFNγ的表达水平（以中位荧光强度MFI表示）呈现短暂的峰值（图1C），其中第5天的CTLs在2h（p=0.020）、3h（p=0.004）和4h（p=0.004）时的上调速度均快于第3天的CTLs。第4天的CTLs在IFNγ MFI动力学上与第5天相似，但其在3h时的上调速度显著快于第3天（p=0.044）。相反，在4h再刺激期间，第3-5天的CTLs中GzmB MFI保持稳定（图1D）。

纵向分析显示了不同的时间模式：IFNγ水平在12h达到峰值，随后在24h显著下降，而GzmB则持续积累。与24h相比，6h、8h和12h的IFNγ MFI显著升高（p=0.021，p=0.017和p=0.021）（图1E）。相反，GzmB MFI表现出逐渐积累的趋势，24h的水平显著高于4h、6h和8h（p=0.021，p=0.037和p=0.039），12h的水平也显著高于4h（p=0.042）（图1F）。

总之，在活化的CTLs中，IFNγ和GzmB的表达呈现出成熟依赖的模式且具有不同的动力学特征。IFNγ的表达是短暂的，而与IFNγ相比，在TCR（再）激活后GzmB的表达持续时间更长。

图1 活化CTL中的细胞内IFNγ和GzmB表达

TCR再刺激下的CTL亚型动态变化

CTLs包含不同的功能亚群，包括TE、TEM和TCM。为了确定IFNγ的表达是否具有亚群特异性，以及TCR再刺激是否会改变培养中CTLs的亚群组成，用10μg/mL固定在平板上的anti-CD3e抗体对活化的CTLs进行了0.5-4h的刺激，并在多个时间点通过流式细胞术分析了亚群标志物（CD44hi用于TE/TEM，CD62hi用于TCM）。

在4h的再刺激过程中，无论培养天数（第3-5天）如何，CD44+细胞的比例（图S1A）和CD44的MFI值（图S1B）均未发生显著变化，表明整个培养物中的效应细胞分化状态保持稳定，不受TCR再刺激或培养时间的影响。相比之下，CD62L+细胞频率（图S1C）和CD62L的MFI值（图S1D）在再刺激后迅速下降（p<0.05），表明从TCM向TEM发生了转化（图2A-C）。

图2A显示了亚群分布。Q1区（CD44+CD62-）为TE/TEM，Q2区（CD44+CD62+）为TCM，Q3区（CD44-CD62+）为TN。第5天的CTLs在再刺激4h以及第4天的CTLs在再刺激1h和4h后表现出比第3天的CTLs显著更多的TE/TEM（p<0.05；图2B）。同时，在再刺激1h后，第5天的TCM频率低于第3天和第4天的CTLs（p<0.05；图2C），证实较长的培养时间促进了再刺激后TE/TEM的分化。

对第5天CTLs中活化标志物（CD25、CD44、CD62L、CD69）的检测显示，在再刺激2h后，CD62L显著减少，而CD69在细胞频率和MFI方面均明显上升（图2D,E），而CD44和CD25则未见显著变化，表明CD62L下调和CD69上调是TCR驱动下从TCM向TEM转化的可靠指标。

图S1 在再激活的CTL中CD44和CD62L的动态表达谱

图2 通过流式细胞术分析的CTL表面激活标志物表达谱

IFNγhi和IFNγlo CTLs的细胞亚型及细胞毒性分析

为了确定IFNγ表达是否与CTL效应功能相关，分析了再激活的CTL，这些细胞表现出高和低IFNγ表达的不同群集（图1A和图3A）。使用10³的荧光强度阈值，将IFNγ阳性的CTL分为IFNγhi和IFNγlo两个亚群（图3A）。延长再刺激时间导致TE生成增加（图2B和图3A）。在再刺激3h和4h后，IFNγhi亚群产生的TE比例显著高于IFNγlo亚群（图3B）。

尽管IFNγhi和IFNγlo CTLs在CD44表达上相似，但IFNγhi CTLs的CD62L水平显著低于IFNγlo CTLs（图S2）。在比较TCM比例时，IFNγlo CTLs中的比例略高，但差异不具有统计学意义（图3C）。在评估IFNγ产生动力学时，IFNγhi CTLs在刺激后2h、3h和4h的IFNγ MFI明显高于IFNγlo CTLs（图3D），而两个亚群之间的GzmB MFI差异不显著（图3E）。

延长的TCR刺激显示，在24h时，IFNγhi和IFNγlo CTLs之间的IFNγ荧光出现了显著差异（p=0.001），而GzmB荧光水平则保持相当（图S3）。在IFNγhi CTLs中，IFNγ荧光在12h达到峰值，随后在24h时明显下降（与4h相比，p=0.042和p=0.0025）。相反，IFNγlo CTLs表现出逐渐上升的趋势，在12h达到峰值后未出现明显下降，并且在6h、12h和24h时的荧光强度均高于4h时（p=0.0483、p=0.0112和p=0.0063，图S3A）。在IFNγhi CTLs中，GzmB荧光在6h、8h和24h时显著升高（与4h相比，p=0.0022、p=0.0075和p=0.0213），而在IFNγlo CTLs中，GzmB荧光仅在12h和24h时有所增加（与4h相比，p=0.0246和p=0.0171，图S3B）。

为了评估细胞毒性能力，检测了CD107a的表面表达水平，这是脱颗粒的一个标志。未受刺激的CTLs表现出极低的CD107a表达（约5%），但在3h再刺激后，其表达水平迅速上升至第3天的21.33%和第5天的57%，其中第5天的脱颗粒水平显著高于第3天（p=0.0109；图3F），表明CTL的脱颗粒能力随着其成熟而增强。值得注意的是，IFNγhi CTLs的CD107a表达始终高于IFNγlo CTLs（图3G）。直方图显示了未标记、IFNγhi和IFNγlo CTLs中的CD107a荧光强度（图3Gi和3Giii）。在第3天，33.75%的IFNγhi CTLs发生了脱颗粒，而IFNγlo CTLs仅为3.76%（图3Gii）。到第5天，脱颗粒比例分别上升至75.47%（IFNγhi）和31.13%（IFNγlo）（图3Giv）。这些结果表明，细胞毒性活性与IFNγ表达水平及细胞成熟程度呈正相关，突显了IFNγhi CTLs在功能上的优势。

图3 IFNγhi和IFNγlo CTL亚群的特征及其细胞毒性潜力

图S2 T细胞激活标志物的流式细胞术分析

图S3 活化CTLs中IFNγ和GzmB表达的时间动态

对IFNγhi和IFNγlo CTLs中IFNγ的亚细胞定位分析

为表征IFNγ在CTLs中的空间分布，分析了IFNγhi和IFNγlo亚群中内源性IFNγ、cis-Golgi以及GzmB之间的Pearson相关系数（PCC）。

IFNγ与高尔基体共定位。将野生型CTLs用包被在板上的aCD3e重新刺激，并对内源性IFNγ和cis-Golgi进行染色。使用ZEN软件进行超分辨率SIM成像，并通过Fiji量化PCC值。结果显示，在野生型CTLs中，IFNγ与cis-Golgi表现出广泛的共定位。在第4天刺激后2h，IFNγhi和IFNγlo CTLs之间的IFNγ-Golgi PCC值未见显著差异（图4A,B），而在第2天再刺激4h后，IFNγhi CTLs的共定位程度显著高于IFNγlo CTLs（图4C,D）。

IFNγ定位于细胞毒性颗粒（CGs）中。为了确定IFNγ是否转运至CGs，在刺激后第2天和第5天分析了GzmB-mTFP KI CTLs中IFNγ与GzmB的共定位情况。GzmB是CGs的标志物。通过SIM成像（图4E,F）及基于Fiji的定量分析（图4G,H）发现，部分IFNγ定位于GzmB+ CGs中，且IFNγhi CTLs中IFNγ与GzmB的共定位程度显著高于IFNγlo CTLs（图4F,H）。

高尔基体与CGs中的定位比较。在GzmB-mTFP KI CTLs中，IFNγ显示出强烈的cis-Golgi定位，且IFNγhi CTLs的定位富集程度高于IFNγlo CTLs（图4F,H）。相反，GzmB在高尔基体上的关联极少，尽管第5天时IFNγhi CTLs的GzmB-Golgi PCC略高于IFNγlo CTLs（图4H）。但在第2天未观察到此类差异（图4F）。

这些研究结果表明：与IFNγlo CTLs相比，IFNγhi亚群维持更高的IFNγ表达水平，并在CGs中具有更强的定位能力。在急性TCR刺激后，新合成的IFNγ在高尔基体中的积累比GzmB更加明显。IFNγ在IFNγhi CTLs中优先向CGs转运，提示其可能直接参与细胞毒性作用，这也与其增强的效应功能相一致。IFNγ的表达是动态调控的，在效应颗粒装载之前会出现短暂的与高尔基体相关的合成阶段。综上所述，这些数据支持一种模型，即IFNγhi CTLs通过协调的IFNγ合成、高尔基体加工和颗粒装载，实现了更强大的细胞毒性活性。

图4 IFNγhi和IFNγlo CTL亚群中IFNγ的亚细胞定位

CRTAM和IFNγ在初始和活化CTLs中的时间调控

为了研究早期和晚期T细胞激活过程中激活标志物与IFNγ表达之间的关系，在TCR刺激或再刺激后的第0天（初始状态）和第5天（激活状态），分析了野生型CD8+ T细胞中IFNγ、CRTAM、CD62L、CD69和CD25的表达情况。

CRTAM和IFNγ表达的动力学。在TCR刺激后，CRTAM和IFNγ的表达均上调（图5A-F，图S4A-C）。CRTAM+ CTLs的比例从1h的5.93%上升至24h的峰值96.6%，随后在72h下降至10.4%；而IFNγ+ CTLs的比例则从1h的5.24%上升至24h的35.6%，之后下降至72h的9.62%（图S4B）。两种分子的MFI在24h达到峰值，到72h时几乎检测不到（图S4C）。值得注意的是，第2天和第3天的CTLs在再刺激后分别在3h和4h恢复了CRTAM和IFNγ的表达，证实了其短暂性和激活依赖性的调控特征（图S4A）。

CRTAM和IFNγ在初始CTL与激活CTL中的比较表达。第5天的CTL表现出比第0天更高的IFNγ+ CTL比例和IFNγ MFI（图5A-C），而初始CTL中CRTAM+ CTL的比例更高（图5D,E）。然而，CRTAM的MFI在第0天和第5天之间没有显著差异（图5F）。伪彩色图的象限分析揭示了不同的共表达模式。在第0天的CTL中，只有20-25%的CRTAM+ CTL表达IFNγ，但在刺激14h后，几乎所有IFNγ+ CTL均为CRTAM+（图5G,I；图S4A）。在第5天的CTL中，约71%的IFNγ+ CTL共同表达了CRTAM（图5H,I）。

初始的IFNγ+ CTLs也表现出比第5天对应的细胞更高的CRTAM MFI（图5J）。值得注意的是，CRTAMhi CTLs产生的IFNγ多于CRTAMlo亚群（图5K,L），突显了CRTAM与IFNγ之间的正相关关系。

激活标志物动态变化。在初始CTL中，CRTAM的上调速度与CD69的诱导相当，且早于CD25的表达（1-6h；图S4A,D,G）。相反，CD62L水平在刺激后下降（图S4J）。到第2天，CTL进入收缩/记忆阶段，表现为CD62L上升以及CD69和CD25下降（扩展图4E,F,I,L）。在TCR再次刺激后，第2/3天的CTL表现出CD62L减少以及CD69和CD25增加（扩展图4E,F,H,I,L），而CD25的比例未发生变化（图S4K）。

研究结果表明，CRTAM和IFNγ以TCR依赖的方式短暂表达。CRTAM作为早期激活标志物，在初始CTL中与IFNγ的产生相关联。CRTAM、CD62L、CD69和CD25共同定义了CTL的激活状态。这些结果表明，CRTAM在初始CTL激活过程中是一个关键的早期响应分子，并在功能上与IFNγ介导的效应反应相联系。

图5 通过流式细胞术对活化CTL中CRTAM和IFNγ的共表达分析。

图S4 原代CTLs中激活标志物和IFNγ表达的时间特征分析

总结

CTLs在抗微生物和抗肿瘤免疫中起核心作用，其通过裂解性和非裂解性细胞毒性机制发挥作用。尽管由颗粒酶B和穿孔素介导的裂解功能已有较明确的研究，但IFNγ在CTL介导的细胞毒性中的作用仍不够明确。这里阐明了激活的CTL中IFNγ的动态表达特征及其对其细胞毒性潜能的功能性贡献。

IFNγ的动态变化与细胞毒性功能。证明，CTL中的IFNγ表达在TCR激活后迅速上升，其峰值早于GzmB的持续表达（图1A-G）。这种短暂的表达模式与CTL的成熟过程一致，表现为向效应T细胞（TE）表型的逐步转变以及CD62L的下调（图2）。值得注意的是，CTL分为明显的IFNγhi和IFNγlo两个亚群，其中前者表现出更强的效应表型（图3A-C）。

有趣的是，尽管IFNγhi CTLs与IFNγlo CTLs的GzmB水平相当（图3E），前者的脱颗粒能力显著增强（图3D,G），这表明IFNγ能够独立于细胞内GzmB表达水平增强溶解性细胞毒性。超高分辨率成像进一步支持了这一结论，结果显示在IFNγhi CTLs中，IFNγ与含有GzmB的细胞毒颗粒共定位程度更高（图4E-H）。这些发现不仅将IFNγ定义为一种免疫调节细胞因子，还表明其在CTL溶解效率中具有直接作用。该结果与先前的研究一致，即具有溶解功能的IFNγ储存在包含GzmB的细胞毒颗粒中，并由效应CD8+ T细胞在免疫突触处共同分泌，这种机制增强了CTL的杀伤能力。有研究表明，CTL通过自分泌方式产生IFNγ可增强其迁移能力，并促进对原代靶向角质形成细胞的杀伤，无论是在体外还是体内实验中均如此。该研究强调了CD8+ T细胞细胞毒功能对局部IFNγ信号的关键依赖性，这对于针对慢性病毒感染和癌症的免疫治疗具有重要意义。

CRTAM作为早期CTL激活的调节因子。调控CTL中IFNγ产生的机制尚未完全明确。这里数据表明CRTAM是一个与IFNγ表达相关的关键早期激活标志物。在初始CTL中，TCR刺激后CRTAM短暂上调，发生在IFNγ诱导之前（图5；图S3）。在初次激活过程中，几乎所有表达IFNγ的CTL都同时表达CRTAM（图S3A），并且CRTAM高表达亚群产生的IFNγ显著高于CRTAM低表达细胞（图5K,L）。

CRTAM在CTL生物学中的作用与其已知功能一致，包括促进CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中IFNγ的产生、调节CD4+ T细胞极化以及决定CD4+细胞毒性T淋巴细胞谱系。它与CADM1的相互作用可能通过将活化的细胞保留在淋巴组织中来促进早期CTL的启动，而在第5天CTL中其表达下降（图5I,J），表明CRTAM在连接早期激活与效应细胞分化过程中具有阶段特异性作用。

未来研究方向。虽然研究建立了IFNγ表达与CTL细胞毒性之间的联系，但CRTAM调控IFNγ的分子通路仍有待进一步探索。单细胞RNA测序可以揭示区分IFNγ高表达和低表达亚群的转录程序，为理解其功能特化提供线索。此外，还需要开展机制性研究，以明确IFNγ是否通过颗粒运输与融合、靶细胞致敏或其他效应通路增强CTL的杀伤功能。

总之，IFNγ和GzmB的表达呈现出依赖于成熟状态的模式，但动力学特征不同。与GzmB不同，IFNγ的产生在TCR（再）激活后迅速且短暂，并不需要成熟的免疫突触形成。进一步证实，CD62L的下调和CD69的上调可作为TCR驱动中央记忆性（TCM）向效应记忆性（TEM）表型转变的可靠标志。从功能上看，IFNγ可能通过促进高尔基体依赖性的加工及更高效地分选至细胞毒性颗粒中来增强CTL的杀伤能力，IFNγ水平的升高与更强的杀伤能力相关。此外，发现CRTAM是原代CTL激活中的关键早期响应分子，可能调控初始阶段的IFNγ表达并参与IFNγ介导的效应功能。综上所述，这些发现为优化针对感染性疾病和恶性肿瘤的T细胞免疫治疗策略提供了机制层面的理论基础。

参考文献：

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Mazet JM, et al. IFNγ signaling in cytotoxic T cells restricts anti-tumor responses by inhibiting the maintenance and diversity of intra-tumoral stem-like T cells. Nat Commun. 2023 Jan 19;14(1):321.

Xue Z, et al. Integrative mapping of human CD8+ T cells in inflammation and cancer. Nat Methods. 2025 Feb;22(2):435-445.

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