Elispot：从单细胞水平解析蛋白质分泌的关键技术

细胞间通讯在细胞动态调控与体内稳态维持中扮演着不可或缺的角色。除直接物理相互作用外，活细胞分泌体液因子也是细胞间通讯的关键途径。鉴于细胞间通讯在免疫细胞社会学中的核心地位，蛋白质分泌的检测已成为研究人员高度关注的领域。

分泌蛋白质的浓度通常借助酶联免疫吸附试验（ELISA）进行测定，该方法可提供细胞分泌至培养基中体液因子的总量，但无法明确分泌相关体液因子的细胞数量，进而难以洞悉相关细胞的激活状态。为解决这一问题，酶联免疫斑点检测（ELISPOT）技术由此诞生。

发展历程

ELISPOT 技术起源于 20 世纪 80 年代。1983 年，澳大利亚 Sedgwick 研究团队首次报道了一种固相免疫酶技术，用于计数特定抗体分泌细胞。该技术基于 ELISA 的经典原理，利用特异性抗体与目标抗原结合形成免疫复合物，随后将免疫复合物固定于固相支持物上，通过酶作用于特定底物产生可视化信号，该信号与特异性抗体分泌细胞的数量呈正相关，可通过计数信号数量确定抗体分泌细胞的数目。同年，瑞典 Czerkinsky 研究团队利用固相酶联免疫吸附技术检测单个 B 细胞分泌的抗体，并首次提出 ELISPOT 的概念。

由于 B 细胞分泌抗体的量相对较多，在早期 ELISPOT 实验环境中较易实现检测。然而随着研究领域的拓展，该技术在 T 细胞免疫研究中面临挑战：T 细胞因子的产量远低于 B 细胞免疫球蛋白，加之抗体质量、显色底膜材质等因素影响，多数研究团队难以获得清晰斑点，表现为检测灵敏度不足、数据分析重复性差。直至 1996 年，美国 Lehmann 团队引入 PVDF 膜，其蛋白吸附性能优于硝酸纤维素膜，且具备更高的条带显色分辨率，成功解决了 ELISPOT 技术中因斑点显色导致的灵敏度偏低问题。

图 1. B 细胞 ELISPOT 检测的标准流程及应用案例

标准流程

随着 ELISPOT 技术的持续优化，其应用场景不断拓展，但其核心检测流程仍保持高度一致性：

• 实验板预处理：将具有亲和性的抗体（多为抗细胞因子或抗抗体）包被于多孔板表面，构建免疫捕获层。

• 细胞孵育与固定：将待测细胞（多为淋巴细胞）加入含刺激物（如抗原或激活剂）的培养基中，诱导其活化并分泌特异性蛋白。随后将孵育后的细胞接种至已包被抗体的实验板，实现细胞固定。

• 特异性结合：固定细胞分泌的特异性蛋白与抗体结合，形成免疫复合物。

• 酶标抗体偶联：加入与免疫复合物特异性结合的酶标抗体，完成信号偶联。

• 底物显色：添加底物，其与酶标抗体作用产生可见斑点。

• 斑点量化：借助显微镜或自动计数仪对板上斑点进行统计，斑点数量反映细胞分泌特异性蛋白的频率。

图 2. T 细胞 ELISPOT 检测的标准流程及应用案例

与其他检测技术的对比分析

若需全面解析细胞因子谱，多种检测手段可提供多维度信息。ELISA、细胞因子微球实验（CBA）及细胞因子蛋白测定（CPA）等技术均可定量检测抗原刺激后活化细胞释放至培养上清中的细胞因子，但这些方法难以实现单细胞分泌事件的可视化分析，且 ELISPOT 的检测灵敏度可达 1 个细胞 / 10⁶个细胞，较传统方法提升 2 个数量级。

作为单细胞水平检测技术，基于流式细胞术的细胞内染色法（ICS）与 ELISPOT 具有以下差异：① ICS 检测细胞内细胞因子蓄积量，而 ELISPOT 量化实际分泌至胞外的细胞因子；② ICS 检测细胞因子分泌时需用分泌抑制剂处理细胞，而 ELISPOT 可实时捕获分泌细胞周围的细胞因子；③ ICS 在预设时间点裂解细胞并检测胞内细胞因子，ELISPOT 则可持续俘获分泌因子；④ ELISPOT 更适用于高通量检测。此外，ICS 可结合流式细胞术分析细胞物理表型，而 ELISPOT 更聚焦于生物功能检测。

图 3. 流式细胞术与 ELISPOT 在 T 细胞功能检测中的应用对比

以 T 细胞免疫功能评估为例，下表列举了常见 T 细胞免疫检测方法的技术特点及优劣分析。

表 1. T 细胞免疫检测技术平台的性能对比

随着科研需求的升级，ELISPOT 单因子检测已无法满足多元分析需求，双色及多色荧光 ELISPOT 技术相继研发完善，显著拓展了应用场景。当前 ELISPOT 技术已广泛用于药物研发、化学毒物评估及细胞因子复合物的生物学特性分析，为体内免疫调节机制提供量化依据。在肿瘤疫苗疗效评价、感染性疾病免疫监测、自身免疫病机制研究、过敏反应机制解析、移植免疫状态评估、肿瘤免疫治疗优化及免疫学基础研究等领域的应用日益深入。