消除经典二硫键可减轻工程化T细胞中的TCR错配

通过利用MHC介导的抗原呈递机制靶向细胞内抗原，TCR-T细胞疗法在治疗实体瘤方面相比CAR-T细胞疗法具有独特优势。然而，尽管潜力巨大，截至目前仅有一个TCR-T疗法获得FDA批准。一个关键挑战在于外源性治疗性TCR链与内源性TCR链之间的错配问题，这不仅降低了膜定位效率，还增加了脱靶毒性的风险。虽然已开发出多种工程策略以增强TCR的表面表达，这里，湖南大学生命医学交叉研究院团队系统评估通过一种新型错配评估平台发现，传统方法可能悖论性地加重链错配问题。通过引入靶向半胱氨酸突变以破坏TCR恒定区中的天然链间二硫键，显著减少了外源性与内源性TCR之间的错配。更重要的是，这些结构改造既保持了高水平的表面表达，又保留了强大的肿瘤特异性杀伤能力。这一创新的工程化方法为具备更高安全性的临床级TCR-T疗法制造奠定了关键基础。

TCR-T细胞疗法通过将外源性TCR基因导入人T细胞，从而重新定向其针对肿瘤细胞的抗原特异性。与CAR-T细胞不同，TCR-T细胞能够识别由MHC分子呈递的抗原肽，这使得它可以靶向细胞内和细胞表面的肿瘤抗原。这一特性使TCR-T疗法成为治疗实体瘤的有前景的方法，并已开展针对多种抗原的临床试验，包括滑膜肉瘤、黑色素瘤和骨髓瘤中的NY-ESO-1抗原。

尽管其潜力巨大，TCR-T的开发仍面临独特挑战。虽然抗原逃逸、on-target/off-tumor毒性以及免疫抑制微环境是其他细胞疗法共有的问题，但TCR-T还存在一个额外的结构限制：其异二聚体的αβ链必须精确配对，以避免与内源性TCR链发生错配。外源性和内源性TCR链之间的结构相似性使得在T细胞工程化过程中可能出现四种可能的异二聚体组合。错配的TCR链（与胸腺选择的内源性TCR不同）可能会表现出自身反应性或异体反应性，从而可能引发off-target毒性和移植物抗宿主病（GVHD）。此外，错配TCR与治疗性TCR之间对CD3复合物结合的竞争会降低功能性TCR的表面表达，进而削弱杀伤肿瘤的效力。尽管GVHD目前仅在临床前研究中被观察到，但消除TCR错配对于确保临床安全性和疗效仍然至关重要。

目前提高TCR配对效率的策略包括：①人源TCR恒定区替换为小鼠来源的对应区域；②引入链间二硫键（α48/β57）；③用疏水性氨基酸修饰α链跨膜域；④引入小鼠来源的稳定突变。尽管在临床研究中，小鼠恒定区替换仍占主导地位，但异种序列的长期表达可能引发免疫原性问题。此外，这些策略组合对消除外源性与内源性TCR错配的影响尚未得到验证。解决这些局限性需要创新的工程方法，在实现高保真TCR配对的同时尽量减少非人源序列的使用。

组合优化的TCR显示出高程度的错配

为系统评估已报道的TCR优化策略对链错配的影响，设计了一种整合多种工程方法的组合型TCR结构，旨在实现高表面表达和细胞毒性的同时，尽量减少非人源序列的使用。此前报道的增强TCR配对的策略包括：①人源TCR恒定区替换为小鼠恒定区；②引入额外的链间二硫键（α48/β57，这里称为4857）；③通过疏水残基替代修饰α链跨膜域（这里称为TMa）；④引入小鼠来源的点突变（这里称为mm）。选用广为人知的HLA-A*02:01限制性1G4 TCR作为研究模型。鉴于完全替换为小鼠恒定区会增加免疫原性风险，在保留人源恒定区的基础上，对1G4 TCR实施了策略②、③和④，从而构建出一种优化的TCR（sTCR）（图1A,B）。与具有完全人源恒定区的TCR（hTCR）相比，sTCR表现出显著增强的表面表达（91.2% vs 36.8%，图1C）。为了评估功能性效力，改造了共表达NY-ESO-1和HLA-A*02:01的Huh7细胞，并稳定表达Luc/GFP（图1D）。当与Huh7-A02-NY-ESO-1细胞共培养时（E:T=1:10共培养24h）， sTCR-T细胞显示出比hTCR-T细胞更强的细胞毒性（图1E）。

为专门评估外源与内源TCR的错配情况，构建了人工错配检测系统（图1F,G）。将sTCR链导入TCRαβ敲除的Jurkat细胞后，两条sTCR链均表现出与内源人TCR链显著的错配倾向（图1H）。这些结果揭示了一个关键矛盾：虽然组合优化提高了表面表达和细胞毒性，但未能解决链错配问题及治疗应用中相关的临床安全性风险。

图1 sTCR表现出优越的细胞毒性，但错配程度较高。

破坏经典二硫键仍能保持工程化TCR的完整功能

保守的αCys95-βCys131二硫键是目前已知介导内源性人TCR链配对的唯一机制。由于转导的治疗性TCR保留了这些残基，尽管该二硫键在天然TCR组装中起着核心作用，但其是否驱动外源与内源TCR的错配仍未被研究。因此，在sTCR恒定区构建了双半胱氨酸突变（αC95A/βC131A），以破坏这一关键的链间二硫键（图2A,B）。令人惊讶的是，半胱氨酸突变体（mutEC-sTCR）在Jurkat细胞中保持了结构完整性，并表现出＞95%的抗原特异性结合能力（Tetramer-APC+/RFP+）（图2C），首次证明功能性TCR配对和膜定位可以独立于这一经典二硫键发生。在原代T细胞中，mutEC-sTCR的表面表达与sTCR相当（89% vs 80%，差异在10%以内）（图2D）。在用肽脉冲的T2细胞刺激工程化的Jurkat后（12h），mutEC-sTCR表现出比hTCR和sTCR更强的活化能力（图2E）。此外，mutEC-sTCR工程化的人原代T细胞与Huh7-A02-NY-ESO-1-luc/GFP细胞共培养24h后进行细胞毒性测定（E:T=1:10），表达mutEC-sTCR的T细胞显示出比hTCR-T细胞更高的细胞毒性，同时与sTCR-T细胞相当（图2F）。这证实了工程化TCR可以在保留优越功能的同时绕过保守二硫键的限制。具体详细的序列突变改造可见CN118108833B专利《引入外源二硫键的TCR恒定区及其产品和应用》。

图2 破坏sTCR的经典二硫键不会影响其功能。

通过消除经典二硫键可减轻TCR错配

为进一步确定通过消除经典二硫键是否可以消除外源-内源TCR的错配，重构了人工错配检测结构，使hTCR与mutEC-sTCR链配对（图3A,B）。在TCRαβ-KO Jurkat细胞中的评估显示，与原始sTCR错配构建体相比，这些突变配置的表面表达显著降低（图3C、图1H）。值得注意的是，缺乏二硫键的β链（mutsB）与内源性α链之间的错配几乎被完全消除（图3C）。

图3 消除经典二硫键可减少TCR错配。

这些结果表明，在消除经典二硫键的同时引入工程化修饰，可以使TCR保持高效的表面表达和强大的抗肿瘤活性，同时最大限度地减少错配。这种设计降低了与错配相关的风险，从而增强了其在未来治疗应用中的临床实用性。

总结

工程化TCR-T细胞疗法在实体瘤治疗中的效果受到TCR错配问题的限制。尽管针对TCR恒定区有多种优化策略，无论是用小鼠恒定区替换TCR恒定区、增加额外的二硫键，还是对TCR跨膜结构域进行疏水性突变，都未能完全解决错配问题，TCR-T细胞的疗效仍有待进一步提高。

为了解决这一问题，通过构建整合了三种恒定区优化的sTCR（4857 + mm + TMa）开创了一种综合方法。尽管这种方法提高了表面表达和细胞毒性，但在TCRαβ-KO Jurkat细胞中，hA-sB-TCR和sA-hB-TCR异二聚体的高表面表达揭示了显著的错配风险。

随后开发了一种新的解决方案，针对经典的αCys95-βCys131二硫键--这是目前已知的内源性TCR配对的唯一介导因子。通过氨基酸突变，删除了sTCR的内源性内在二硫键，突变体mutEC-sTCR仍能表现出高水平的表面表达。mutEC-sTCR工程化T细胞的活化和细胞毒性与sTCR相当，这证明破坏经典二硫键不会影响其组装和功能。尽管这种优化后的TCR在体外具有优异的肿瘤细胞毒性，其在体内的安全性及抗肿瘤效果仍需在动物模型中进一步验证。

mutEC-sTCR的错配模型（hAmutsB-TCR和mutsAhB-TCR）显示外源性与内源性TCR错配减少。然而，尽管β链错配几乎完全消除，优化后的α链仍导致一定程度的错配。造成这种差异的原因尚不清楚。部分错配的减少表明，可能存在尚未发现的其他机制，在已知的经典二硫键之外影响TCR的相互作用。

这里双管齐下策略--保留结构优化的同时消除经典二硫键--显著降低了错配风险，且不影响功能。这是TCR工程领域的一项范式转变。基于本研究，未来的工作可以围绕以下方面展开：（a）开发针对α链的特定解决方案以消除残余错配；（b）通过结构研究阐明替代的链配对机制；（c）在NSG小鼠肿瘤模型中验证长期安全性和有效性。

总之，本研究为具有增强安全性的临床级TCR-T制造提供了关键基础，推动了有效的实体肿瘤免疫治疗的发展。

Dan Su, Guangna Liu. Targeted Ablation of Canonical Disulfide Bonds Mitigates TCR Mismatching in Engineered T Cells. bioRxiv. 2025

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