全面的功能性自身抗原筛选以评估多反应性工程TCR的交叉反应性

TCR疗法是一种新兴的生物和细胞类药物模式，具有独特的能力，能够靶向细胞内抗原，并且精确区分健康细胞与感染或突变的细胞。开发新型TCR疗法的一个障碍在于，工程改造这些蛋白以增强治疗效果的同时，需要避免引入意外的脱靶自身反应性。在这里，不列颠哥伦比亚大学研究团队，应用一种功能性的高通量筛选方法，Tope-seq，用于检测＞5×10^5个独特肽编码序列文库中的交叉反应性表位。对一个亲和力增强的工程化TCR进行了回顾性分析，该TCR因表位交叉反应导致严重脱靶毒性而临床试验失败。通过针对所有基因组编码的自身抗原进行综合功能性测试，使用Tope-seq方法，在初次批量筛选中以p < 0.01的显著性阈值识别出了介导脱靶反应的表位。还发现了该工程化TCR感兴趣的其他潜在交叉反应性表位，这表明评估基于TCR疗法的多反应性需求比之前认识到的更为重要。

T细胞功能的核心是TCR，这是一种通过生发中心编码的VDJ基因体细胞程序性重排生成的、锚定在膜上的免疫球蛋白家族成员蛋白。个体内的T细胞群体由数百万个克隆组成，每个克隆表达一种独特的TCR基因片段重组配置。每个TCR与短肽表位相互作用，这些短肽表位来源于细胞蛋白质的蛋白酶体降解，在内质网中加载到MHC分子上，并展示在细胞外表面。由此产生的肽/MHC复合物代表了单个细胞蛋白质组学特征的采样，包括外来生物体表达的蛋白质，并接受外周T细胞的检查。不同的TCR克隆型对肽/MHC配体具有特定的结合偏好，如果形成了正向的TCR-肽/MHC相互作用，就会启动T细胞效应功能。总体而言，携带各自TCR的T细胞库提供了广泛的保护，防止胞内病原体或肿瘤发生。

T细胞发育过程中TCR生成的半随机化过程在胸腺中受到调节，新生的TCR蛋白在此处通过与自身抗原pMHC接触，经历一个称为中枢耐受的过程。对胸腺中自身抗原反应强烈的重排克隆型会被清除，从而形成对外周健康组织耐受的TCR库，但同时能够对异源或改变的肽段作出反应。近年来，通过识别对TAA特定肽段有反应的TCR，并将其转化为可溶性T细胞衔接蛋白生物制剂或重组TCR-T细胞疗法，人们在将TCR作为治疗剂用于肿瘤学领域进行了研究。在这些治疗背景下，应用非自体、工程化或超生理水平的TCR绕过了中枢耐受的自然机制，因此必须在体外环境中全面评估其自身反应性，以确保新型TCR基础治疗的安全性和耐受性。

由于TCR反应既具有精确性，能够区分仅相差一个氨基酸的肽段序列，又同时具有高度的交叉反应性，可以对数百万种潜在表位作出反应，因此在该领域中描绘自身反应性仍然是一个挑战。精细辨别与受体-配体杂泛性之间的相互作用受到多种生物物理和信号现象的调控，例如连续触发、动力学校正以及免疫突触处的空间位阻效应。仅依赖于TCR与pMHC之间亲和力的方法，如可溶性多聚pMHC染色试剂或pMHC酵母/病毒展示技术，常被用作T细胞反应功能触发的替代指标，但存在忽略具有高功能潜力的低亲和力肽段的风险。此外，即使具有人源化HLA的动物模型，也由于跨物种蛋白质组不匹配，不足以评估人类TCR。近期，基于机器学习的预测工具已成为应对这一挑战的主要创新领域，但由于缺乏经过功能验证的训练数据，这些方法尚未成为实际解决方案。在治疗性TCR开发流程的早期进行全面的功能性自身交叉反应评估，对于加快新型TCR生物制剂和细胞疗法的先导物识别及临床前表征至关重要。

之前描述过一种功能性的高通量筛选方法，用于分析针对大量短肽编码DNA序列库的CTL反应，这种方法被称为T细胞表位测序（Tope-seq）。简言之，该方法利用靶向合成抗原呈递细胞（sAPC）中编码的对颗粒酶B（GZMB）敏感的荧光报告子基因。当与表达抗原响应型TCR的CTL混合时，CTL向靶标sAPC递送GZMB（这是被激活的CTL的一种自然反应）会因酶切作用导致荧光特性发生变化。GZMB读数与传统的T细胞活化诱导标志物或靶细胞裂解检测不同，它是一种可检测的早期T细胞反应信号，位于靶细胞内，能够在细胞因凋亡而丢失之前，从群体中精确选择出携带相关抗原的细胞。因此，它可用于高通量功能筛选：①将大型DNA编码的小基因库以整合到基因组的慢病毒载体形式导入表达报告基因且HLA匹配的靶sAPC（图1a）；②将sAPC库与感兴趣的CTL群体共培养；③通过FACS在共培养后对sAPC进行分选，以回收可能含有抗原性小基因的细胞（图1b）；④通过对回收细胞进行小基因测序来揭示负责CTL活性的肽编码序列（图1c）。在小鼠模型系统中，使用来自外周组织和肿瘤浸润的原代T细胞对随机小基因库进行了验证。还曾在人细胞系中实施了荧光GZMB检测系统，并在重组表达的TCR和MHC背景下对其进行了展示。

图1 Tope-seq平台的示意图总结。

在这里，目标是将Tope-seq技术应用于TCR自身反应性的特征分析，同时解决由内源性抗原引起的背景信号挑战。在此，将该平台用于对a3a（一种体外亲和力增强的TCR，由于意外的交叉反应性导致心脏毒性而在临床试验中失败，该TCR见Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells）及其野生型胸腺选择的对应物EB81.103，针对涵盖所有可能基因组编码肽段的大规模潜在表位库进行全面的功能特性分析。发现，治疗靶标表位EVDPIGHLY（来源于MAGE-A3蛋白）通过Tope-seq可被两种TCR检测到，而之前确定为临床失败原因的交叉反应性表位ESDPIVAQY（来源于Titin蛋白，TTN）仅在亲和力增强的a3a分析中被检测到。还报告了构建潜在表位库的策略、应对内源性表达蛋白带来的背景问题的方法，以及对大规模Tope-seq数据集进行生物信息学分析的手段。

构建覆盖自身抗原空间的小基因库

为了对完整的自身抗原小基因库进行Tope-seq筛选，首先需要开发适合在报告靶细胞中表达的合适文库。为此采用的一种方法是全蛋白组编码（WPC）小基因合成策略，通过在计算机上设计一组代表人类编码基因组可能表达的所有肽段的氨基酸序列来实现。具体操作是将人类参考蛋白组中的每个蛋白编码序列通过提取平铺的氨基酸片段进行计算机拆解，并通过反向翻译将其转换为DNA小基因。在构建平铺片段之前，会先整合在蛋白异构体或高度同源蛋白中观察到的冗余蛋白结构域，以避免最终片段库中肽段子序列的过度表示。生成的＞5×10^5个小基因集通过阵列合成（Twist Biosciences）制备成单链DNA寡核苷酸池，随后将其克隆到慢病毒转移质粒中。通过从初始文库质粒库存直接扩增的小基因进行NGS分析，对制备的WPC文库质粒进行了表征，结果显示超过97%的测序读数成功映射到设计的参考小基因，且设计文库中超过97%的成分得到体现，表明引入的伪影或序列丢失发生率非常低。

随后，使用制备好的质粒生成慢病毒载体，并将其转导至先前经过改造以表达HLA-A*01:01/GZMB-FRET报告基因盒的K562细胞（称为KFRET.A0101细胞系）。最初的转导策略采用低MOI（MOI=0.2）方法，以概率上确保每个细胞中不超过一个小基因整合。转导和纯度分选后，通过对接收自细胞的小基因扩增子进行NGS分析，评估了WPC小基因库的整合情况。平均而言，重复样本中检测到了86.9%的设计小基因序列。然而，当考虑所有四个重复样本的并集时，数据合并后的深度增加，导致文库覆盖范围与源质粒大致相似。因此，认为在转导步骤中并未引入瓶颈效应，因为采样更多细胞几乎实现了完全覆盖。

基于这一发现，重复进行了WPC小基因库的转导，以增加细胞表达文库中小基因的代表性。通过提高文库转导的MOI（MOI=7）并允许每个目标细胞携带多个小基因拷贝，产生了第二轮KFRET.A0101.WPC文库。尽管采用高MOI方法存在搭便车的小基因被纳入FRET位移的小基因群体并在Tope-seq中被错误检测的风险，但预计，通过在足够大的规模上进行转导，确保每个小基因的克隆冗余性，从而降低任何真正阴性的搭便车小基因在创始克隆群体中反复与真正阳性的表位共同出现的可能性。评估了转导后高MOI WPC小基因文库的整合情况，并确定每份高MOI重复样本代表的设计小基因文库超过97%。因此，高MOI文库策略被用于后续的Tope-seq实验。

在合成WPC文库开发的同时，采取了另一种策略来生成用于靶标报告细胞表达的小基因文库。以原始核酸作为构建小基因文库的材料来源，在这种情况下，使用来自多位健康供体混合的正常人类基因组DNA，构建了一个全面的自身抗原小型基因文库。基因组起始材料通过声波剪切，并进行了外显子捕获和接头化处理。这些步骤由Genewiz按照Illumina文库构建的标准流程完成，并且没有继续进行外显子测序，而是插入了小基因载体文库克隆和靶标细胞系创建步骤，以准备可用于Tope-seq的外显子小基因文库。由于在这种形式下，没有预设的预期文库大小，与WPC小基因文库的情况不同，因此省略了质粒水平的质量控制测序，而是通过采样转导细胞并对其中回收的小基因扩增子进行NGS分析来评估文库多样性。该分析结果显示，初始的WES细胞文库代表了＞2.5×10^7个独特的小基因片段（或人类外显子组的覆盖率大于100倍）。值得注意的是，WES格式文库的多样性明显高于WPC文库。这是可以预期的，因为WES片段是通过随机断裂点剪切DNA生成的，并以6种可能的阅读框插入到慢病毒载体盒中。

初始文库在带有内源性表位的sAPC中的筛选未成功

在之前的工作中，在共培养EB81.103和a3a TCR-T细胞对抗KFRET.A0101细胞时，观察到了FRET位移信号，而此时并未引入任何小基因。这表明这些细胞中可能存在内源性MAGE-A3蛋白以及其他自身抗原，怀疑这可能成为基于文库筛选实验的背景来源。来自宿主细胞蛋白的表位会使目标群体中的所有细胞都能通过FRET位移FACS进行选择，无论其中包含哪些转导的小基因。试图评估这种背景会在多大程度上干扰对外源小基因文库的检测，并进一步探究是否即使存在内源性抗原，测试TCR已知的反应性仍能被检测到。

初步筛选是通过将a3a CD8+ TCR-T细胞与包含WPC或WES小基因库的KFRET.A0101细胞共培养进行的。在每次筛选实验中，分离出FRET位移和未位移的目标细胞群。细胞捕获后，从每个分选门回收的细胞分别进行基因组DNA纯化。通过靶向PCR扩增并测序捕获的基因组DNA样品中整合的小基因。小基因测序后，数据通过专门为WPC或WES实验开发的Tope-seq分析流程处理（图1c）。通过计算每个文库序列在位移门样本中的归一化计数相对于两个门总归一化计数的比例来衡量富集程度（rfs）。每个rfs分数，作为文库群体的一个采样比例，呈正态分布。因此，为每个小基因或参考肽段序列生成了Z分数和P值以进行显著性检验。

对重复进行的WPC实验结果的分析显示，包含已知MAGE-A3和TTN表位的小基因并未显著高于背景水平。同样，WES实验也表明，在这些条件下，阳性对照表位无法从背景中检测出来（图2）。这证明了T细胞对非文库编码表位的反应超过了对来自外源小基因文库的表位的反应。为调查是否确实如此，并排除检测限作为这一结果的原因，在缺乏来源于宿主细胞蛋白的内源性表位的sAPC细胞体系中重复了文库筛选。

图2 使用未编辑的K562靶标底盘对a3a TCR-T进行Tope-seq评估。从初始测试中获得的Tope-seq数据读出，测试内容为a3a TCR-T细胞与含有WPC文库(a)或WES文库(b)的KFRET.A0101细胞共培养的结果。在两次实验中，效应细胞与靶细胞的比例均为1:1进行共培养。每次筛选时，超过6×10^7的靶细胞文库与TCR-T细胞孵育12h后，通过FACS分离移位和未移位细胞。回收的细胞经过基因组DNA提取和小基因扩增后进行Illumina测序。计算每个小基因（针对a）或9-mer编码基因组位点（针对b）在移位中的读数频率相对于移位+未移位的归一化读数计数，并用于计算绘制在y轴上的Z分数。每个灰色点代表一个单独的小基因或9-mer肽编码位点。含MAGE-A3和TTN表位的控制小基因（针对a）或来自MAGE-A3和TTN的最小表位（针对b）根据图例突出显示。y轴上以实线表示显著性阈值p=0.01（Z分数高于该线则p<0.01）。

替代靶细胞体系规避了内源性背景

在观察到使用携带EB81.103和a3a TCR天然反应性的靶细胞系时，监测的测试抗原无法通过背景区分后，推测避免内源性抗原背景的策略将能够检测来自复杂自身抗原库的阳性对照表位。在之前的研究中，开发了KFRET.A0101细胞系的CRISPR/Cas9编辑版本，其中MAGE-A3基因天然位点内的EVDPIGHLY表位已被删除。发现这一基因干预消除了与EB81.103 TCR-T细胞共培养时的背景FRET位移反应。然而，尽管在基础细胞系中从基因组水平去除了目标表位，在流式细胞术检测中，a3a TCR-T细胞与KFRET.A0101.MAGEA3-/-的共培养信号无论是否重新引入MAGE-A3小基因均无差异。认为这可能是因为K562细胞系中其他潜在的交叉反应性表位内源性表达所致。

为验证这一假设，在本研究中确认了一种替代的"纯净"靶细胞底盘，用作Tope-seq小基因文库筛选的宿主细胞系。为此，基于721.221构建了sAPC，这是一种通过γ射线诱变使MHC缺失的EBV转化的B淋巴母细胞系。与K562类似，尽管失去了自身的MHC I类α链表达，721.221细胞仍保留B2M表达以及生成表面pMHC复合物所需的抗原处理和呈递机制，只要提供HLA-I编码序列即可。通过病毒转导将基础721.221细胞转化为721FRET.A0101细胞，使其具备HLA-A*01:01和FRET报告基因。随后，将这些靶细胞（无论是否携带小基因或进一步转导MAGE-A3小基因）与a3a TCR-T细胞共培养，以确定FRET移动信号与背景的比例。此次测试的结果（图3）表明，721FRET.A0101.MAGEA3(143-202)细胞产生了可与阴性对照区分的小基因特异性反应，证明在K562中表达的干扰a3a TCR评估的自身表位并未在基础721.221细胞系中表达。

图3 以721.221为基准的靶细胞不会引发a3a的内源性背景反应。

使用WPC文库进行的全面自身肽评估

基于这些结果，重复了对表达于721FRET.A0101靶细胞底盘中的WPC小基因文库的a3a TCR-T细胞的Tope-seq分析。同时，着手研究针对编码于KFRET.A0101.MAGEA3-/-细胞（原生MAGE-A3基因敲除系）中的WPC文库的野生型EB81.103 TCR-T细胞。为了准备这些实验，在与之前WPC实验相同的感染复数和总规模下，通过慢病毒转导在其各自的细胞底盘中生成了新的靶标文库群体。在文库细胞系纯化分选和TCR-T制备后，每种条件下的Tope-seq实验均以重复形式进行。FRET位移FACS分选和小基因测序按照初始筛选实验的方式相同执行。

这些Tope-seq筛选结果显示，新的细胞文库代表了超过97%的文库序列，与之前版本相似，并且在两种实验条件下均成功检测到了阳性对照小基因。在EB81.103 TCR筛选中，包含EVDPIGHLY表位的两个MAGE-A3小基因显著富集于背景之上（p<0.001，rank>99.99百分位），而包含ESDPIVAQY表位的两个TTN小基因未见显著富集（图4a）。在a3a TCR筛选中，MAGE-A3小基因显著富集（p<0.001，>99.8百分位），而在这种情况下，两个TTN小基因也被发现显著富集（p<0.001，rank 99.8百分位）（图4b）。这些结果反映了最初的临床病例报告中的发现，该报告是在体内观察到严重脱靶交叉反应后完成的，并表明使用Tope-seq对WPC文库进行全面自身抗原筛选，可以在a3a TCR的发现和开发阶段将这种交叉反应确定为风险因素。这一结果还证实了假设，即消除对宿主细胞抗原的反应足以支持基于Tope-seq的针对复杂自身抗原文库的TCRs-of-interest的评估。

图4 在干净的靶标底盘中，对EB81.103和a3a TCR针对WPC文库的Tope-seq评估。

通过聚类对Tope-seq数据进行生物信息学优化

进一步进行了生物信息学分析，以研究在WPC实验中富集超过p<0.01阈值的其他小基因（在EB81.103实验中n=1850；在a3a实验中n=2283）。有趣的是，在未经编辑的sAPC中进行的原始不成功的a3a TCR-T/WPC文库实验中，发现达到统计阈值的小基因数量减少了三倍（n=758）。目标是检查潜在的交叉反应是否源自共同的表位基序，或者对于所研究的任意一种TCR是否出现了多个表位簇。为此，使用聚类方法分析了两次实验中每个小基因中嵌入的所有8-11残基肽段序列。第一步是对肽列表进行初步过滤，去除来自非显著性（p>0.01）小基因的肽段。然后，确定了在多个不同小基因中出现的肽段中哪些序列比偶然出现的频率更高（双项精确检验）。经过初步过滤后，通过使用NetMHC 4.0进行p-MHC结合预测对肽段序列进行了进一步过滤。为了避免在分析中引入过多偏差，应用了非常低的严格度截止值（rank score <5）。随后，使用GibbsCluster 2.0对肽段进行分组，这是一种基于Gibbs采样方法的算法，用于同时对复杂序列集合中的基序进行对齐和聚类。基序检测通过从随机生成的肽段中生成基序的基础分布，并对每次实验衍生基序的GibbsCluster分数与基础随机肽段基序分数分布进行显著性测试来完成（图5a）。

总体而言，仅有两个基序的GibbsCluster分数具有统计学显著性，且均来自a3a TCR数据集（图5b、d）。考虑到a3a是一种已知具有广泛反应性和自身反应性的工程化TCR，而EB81.103是一种胸腺选择的TCR，在自身抗原库中不太可能形成反应簇，这一结果并不出乎意料。还观察到这两个出现的基序源自不同的肽段长度分析，但在生成它们所用的核心肽段中存在显著重叠。发现的基序包含来自MAGE-A3和TTN的已知阳性表位，以及之前研究中报道过的其他反应性。还检测到了一些未被先前报道的反应性，这些可能是a3a TCR的新发现的自身表位（图5c、e），其中一些在人类蛋白质图谱参考数据中显示出较高的组织特异性表达（表1），并且也可能具有潜在的临床意义。在a3a筛选中的一些潜在WPC阳性结果也在K562细胞系的人类蛋白质图谱数据中显示出表达。这些潜在的K562特异性抗原在721.221细胞中的表达水平相对较低，为以下假设提供了证据支持：即本实验中检测到的一些潜在表位可能在基于K562平台的文库筛选中贡献了背景信号。

图5 在a3a TCR-T WPC筛选的结果中出现了相似性的聚类。

表1 a3a TCR-T WPC筛选中潜在自身抗原命中在组织和K562细胞系中的特异性表达。

生物淘选作为一种克服内源性反应性的策略

这里，通过基因组编辑删除内源性表位或开发替代的干净目标细胞底盘以准备适合基于Tope-seq的自身抗原评估的文库宿主的策略是有效的。然而，这些方法并不总是可行，特别是在假设的自身交叉反应未知或位于无法敲除或规避的本质基因中时。因此，除了探索工程化或替代目标细胞系以避免内源性抗原带来的背景问题外，还试图研究是否可以通过反复重新筛选选定的小基因来逐步富集表位，从而克服这一背景问题，这种方法类似于噬菌体展示技术中使用的生物淘选技术。由于WES文库中小基因的独特多样性远高于WPC，在这些文库中测试了生物淘选方法，预期在第一轮和第二轮实验之间文库多样性的显著减少将能够清晰地观察到富集效果。假设分为两点：首先，预计重新筛选在第一轮实验的高通量测序文库制备过程中产生的剩余移位门扩增子，将导致已知阳性表位的富集评分逐渐提高。其次，预计大多数在第一轮中具有显著富集评分的肽段在第二轮中将未被检测到或不再具有统计学意义。

通过重新对第一轮筛选中获得的移位门小基因进行适配子化处理，以便通过PCR克隆，并将其插入到文库表达慢病毒转移质粒中，构建了第二轮的WES文库。克隆后的第二轮文库被用于生成慢病毒载体，并在未经过CRISPR编辑的KFRET.A0101细胞底盘中创建文库细胞系。对准备好的第二轮文库进行高通量测序质量控制采样显示，两个文库均包含1-2×10^6个独特的小基因（占原始文库中小基因的4-8%）。针对第二轮文库，分别对含有EB81.103或a3a TCR的TCR-T细胞制备进行了Tope-seq实验。结果显示，在EB81.103 TCR实验中，MAGE-A3的EVDPIGHLY表位在两轮筛选后显著富集于背景之上（p<0.001，rank>99.99百分位），而TTN的ESDPIVAQY表位并未显著富集（图6a）。在a3a TCR筛选中，MAGE-A3表位显著富集（p<0.001，rank>99.9百分位），而TTN表位在两轮筛选后也被发现显著富集（p<0.01，rank>95百分位）（图6b）。这些结果与干净背景细胞中的WPC文库分析中观察到的结果相似，表明反复重新筛选，或生物淘选，可以作为一种工具独立使用，或者可能与底盘编辑策略结合使用，以应对活体宿主sAPC中自然发生抗原引起的背景问题。

图6 在WES文库的第二轮淘筛中观察到的富集情况。

随后，进一步研究了数据集中其他富集肽段的广泛模式。为此，对来自8mer、10mer和11mer参考窗口设置的肽段进行了评分。在所有分析中，a3a实验在两轮筛选后达到显著性阈值的肽段数量比EB81.103实验多出10倍以上（表2），这可能反映了a3a TCR相较于其野生型、胸腺选择的对应物具有更高的杂交性。重复上述针对WPC实验的过滤和聚类分析时，无法从WES文库格式中得出新的具有统计学意义的肽段基序。由于第二轮WES泛素化文库仍然包含比WPC文库更多的独特小基因，认为需要额外的泛素化步骤才能通过这种方法检测到反应性簇。还观察到，在第一轮中达到p值截断标准的大多数肽段（所有分析均超过93%）在第二轮中未被重新发现，这支持了假设，即泛素化方法对于去除背景是有用的。然而，与随机预期相比，更大比例的第一轮命中肽段在第二轮中可被重新发现（EB81.103和a3a 9mer分析分别为1.4%和6.3%，单尾精确二项检验p<0.001）。此外，尽管数据集大致平均分为得分增加的肽段（上升者）和得分下降的肽段（下降者），但在两项实验中，显著比例的上升者群体在第二轮筛选中达到了截断标准（EB81.103和a3a 9mer分析分别为1.6%和13.3%，单尾精确二项检验p<0.001），这为免疫原性表位的正向富集提供了证据。

表2 WES自身抗原库在Tope-seq生物淘选两轮中的潜在富集动态总结。

总结

从a3a TCR灾难性失败的原始病例报告中得出的一个重要教训是，在治疗开发的早期，迫切需要针对尽可能广泛的自身抗原对工程化治疗性TCR进行功能评估，以排除危险的脱靶交叉反应。这项研究中，使用a3a TCR作为测试案例，评估Tope-seq在直接筛选基因组中编码的所有肽段以检测其引发自身反应潜力方面的实用性。

目前，探查TCR交叉反应性最常见的体外功能检测方法是基于使用部分随机化的肽池对靶细胞进行肽脉冲处理，以推导出TCR触发所必需的潜在重要残基。该技术的主要缺点在于：①未考虑细胞中用于生成天然pMHC的抗原处理和呈递机制中存在的固有偏差；②在超生理水平的pMHC丰度下检测TCR；③间接进行，可能无法识别与索引肽没有显著序列相似性或代表不同表位簇的交叉反应性；④需要为每种新索引肽生成不同的定制肽库。相比之下，Tope-seq作为一种互补的功能交叉反应性评估方法，该方法保留了文库肽段的自然表达、处理和呈递。包含明确表位panel的遗传编码细胞库，例如所有可能的自身抗原，具有优势，因为它们可以直接搜索，而无需根据退化肽的结果推断交叉反应性。此外，与Tope-seq检测读数结合使用的小基因库系统可以在不同TCR、HLA或目标肽背景下灵活重用，而无需重新合成。

为了验证Tope-seq方法对全面自身抗原库的评估，如同任何功能性活细胞检测一样，考虑靶细胞底盘中内源性肽段产生的非特异性背景是至关重要的。发现，测试TCR的表位确实来源于天然表达的宿主细胞蛋白，这在分析小基因库衍生的表位时是一个干扰因素。为此，采用了诸如通过CRISPR/Cas9去除已知表达的表位以及适应替代细胞底盘系等解决方案来解决这一问题。尽管在本研究中这些方法取得了成功，但它们并非普遍适用，因为内源性背景表位可能未知，或者存在于不可或缺的基因中。因此，还通过小基因库进行迭代生物淘选，逐步提高每一轮的命中率，以此克服内源性肽段背景。通过直接重新克隆并重新表达捕获的小基因的原始DNA来进行第二轮Tope-seq分析，这种方法即使在存在内源性表位的靶细胞底盘中，也能有效增加已知表位的富集。

WPC和WES自身抗原Tope-seq实验中观察到虚假命中的富集现象。这一发现也在其他使用类似同时期开发的基于GZMB的文库筛选技术进行自身抗原评估的研究中得到印证，这些研究通过进行多达八次重复实验来充分降低背景信号，从而能够表征野生型、未增强亲和力的TCR。在此，通过实施改进的生物信息学工作流程，旨在从较少的重复实验中更准确地判定命中结果，以对此进行优化。还发现，上述描述的生物淘选方法提供了一种可行的技术手段，可用于进一步提高大规模文库筛选中的信噪比。

小型基因文库制备方法的选择是开发Tope-seq筛选活动中的另一个重要考量因素。Tope-seq系统的灵活和模块化特性使得多种DNA来源可以作为小型基因文库的来源。这里描述了两种生成待检测肽段编码序列panel的替代途径，这些序列将由感兴趣的TCR进行分析。在一种方法中，使用了一个明确的、计算机设计的、阵列合成的自身抗原文库版本；而在另一种方法中，对原代样本的基因组DNA进行了剪切并进行了外显子组捕获。根据具体的实验需求，可以开发和应用各种类型的小型基因文库用于Tope-seq筛选活动。在表3中，讨论了不同类型的小型基因文库格式的优点和缺点。

总之，这里介绍了Tope-seq方法的最新进展，包括综合合成和捕获的DNA编码自身抗原小型基因文库的开发、sAPC底盘细胞系工程以及迭代功能小型基因再筛选技术。证明，这项技术在评估治疗性TCR先导候选物对健康组织的功能性脱靶效应和危险的交叉反应方面具有重要的潜在应用价值。预计，基于功能的高通量筛选技术在治疗性TCR早期发现阶段的应用，将能够在资源密集型临床前分析之前，有效降低风险、进行先导候选分子的分类和重新设计。

表3 有多种方法可用于构建通过Tope-seq筛选的遗传编码小型基因文库。

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