CRISPR系统检测复杂单核苷酸变异性能再进一步！

单核苷酸变异（SNV）是基因变异的一种形式，与多种严重疾病的发生密切相关，如癌症、单基因遗传病和传染病。准确检测SNV对于疾病诊断和精准医疗至关重要。然而传统的CRISPR-Cas12aSNVs检测由于细微的自由能变化难以实现准确鉴定，特别是摆动碱基对和高鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）区域中的SNVs。

对此，来自湖南师范大学的研究人员创新性地开发了一种新型CRISPR-Cas12a系统--高能量惩罚单核苷酸变异检测（HEPSD）平台。该平台通过引入非平衡杂交机制，显著提升了CRISPR系统在检测复杂单核苷酸变异（SNV）类型中的性能，为精准检测和诊断相关疾病提供了新的技术手段。相关研究成果"Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants"近期发表在《Nucleic Acids Research》（IF:16.6）上。

文章亮点：

1、创新性开发了高能量惩罚SNV检测（HEPSD）平台，通过非平衡杂交机制显著增强了对单核苷酸变异（SNV）的检测能力

2、HEPSD平台能够有效区分高GC含量区域和摆动碱基对等难以检测的SNV，克服了传统方法的局限性

3、该平台能够检测到低至0.01%变异等位基因频率的突变，展现出对低丰度突变的高灵敏度检测能力

4、通过分子动力学模拟和荧光各向异性测量，揭示了HEPSD平台的非平衡杂交机制，为CRISPR系统的特异性调控提供了新的思路

一、HEPSD平台的设计

前人研究发现，传统的CRISPR-Cas12a系统在识别错配目标时，自由能变化（ΔG）较小，难以有效区分野生型和突变型序列。为了提高对SNV的检测能力，需要设计一种能够显著增加错配能量惩罚的系统。

研究人员为此设计了一种二元crRNA架构，通过非平衡杂交驱动的调控机制，放大了单核苷酸错配的能量惩罚。这种设计称为高能量惩罚 SNV 检测（high-energetic-penalty SNV detection ，HEPSD）平台。它使得CRISPR/Cas12a系统在整个靶向区域内对基因组DNA中的突变表现出显著的偏好，同时防止了由单个错配核苷酸诱导的假激。

图1. 设计图示

二、平台性能验证

1、热力学分析

紫外熔解实验结果显示二元探针（binary probe，BPs）在25°C至50°C范围内表现出稳定的杂交特性，而线性探针（linear probe，LPs）仅在高于68°C时才表现出显著的杂交特性；圆二光谱分析观察到BPs在匹配目标时表现出典型的RNA/DNA双链特征，而在错配目标时信号显著减弱。结果表明BPs在较宽的温度范围内表现出稳定的杂交特性，且在识别错配目标时表现出显著的能量惩罚，增强了对SNV的区分能力。

图2. LP和BP的鉴别表征

2、荧光猝灭分析

荧光淬灭分析Cas12a与RNA（crRNA或BP辅助的crRNA）的结合过程显示，

传统CRISPR-Cas12a系统的ΔG为0.55 kJ/mol，而HEPSD平台的ΔG增加到3.13 kJ/mol。结果表明HEPSD平台在识别错配目标时表现出更高的能量障碍，显著抑制了Cas12a的激活，提高了对SNV的识别能力。

图3. 匹配或不匹配靶标的普通CRISPR/Cas12a系统与HEPSD之间的△G和△△G值的比较分析

3、分子动力学研究

为了了解HEPSD系统在识别匹配和不匹配目标时的杂交动力学，研究人员进行了分子动力学模拟研究。均方根偏差（RMSD）分析结果显示，匹配目标的RMSD值在10 ns后稳定，而错配目标的RMSD值持续波动。该结果说明了HEPSD平台在识别错配目标时表现出动态不稳定性，而在匹配目标时则表现出稳定的结合，进一步证实了其高特异性检测能力。

图4. 匹配或不匹配靶标的CRISPR/Cas12a (C)和HEPSD (D)进行MDs模拟的RMSD分析

4、荧光各向异性测量

通过荧光各向异性测量研究HEPSD平台在识别匹配和错配目标时的结合稳定性时发现，匹配目标的荧光各向异性值较高，而错配目标的荧光各向异性值较低。结果说明HEPSD平台在识别错配目标时表现出较低的荧光各向异性值，表明其结合较弱，进一步验证了其高特异性。

图5. HEPSD与匹配或不匹配的目标的结合稳定性FA分析

三、临床样本检测

研究人员使用HEPSD平台对收集的132个临床样本（包括BRAF V600E和EGFR L858R突变）进行了检测。结果显示，在104个BRAF V600E样本中，88个突变型样本和16个野生型样本的检测结果与NGS结果高度一致；在20个EGFR L858R样本中，11个突变型样本和9个野生型样本的检测结果与NGS结果高度一致；在8个临床血浆样本中，HEPSD平台检测到的突变型样本与NGS结果一致。这些结果证实了HEPSD平台能在临床样本检测中实现了100%的准确率。

图6. BRAF V600E和EGFR L858R样本的临床分析

综上所述，研究人员巧妙地重新设计了CRISPR/Cas12a系统中的CRISPR RNA（crRNA）杂交区域，借助非平衡杂交驱动机制，显著提升了单核苷酸错配的能量惩罚。基于此，他们成功开发出一种高能量惩罚单核苷酸变异检测（HEPSD）平台，极大地增强了对单核苷酸变异（SNV）的检测能力。该平台能够将BRAF V600E和EGFR L858R这两种肿瘤突变的变异等位基因频率检测至0.01%的水平，并且精准区分了132对临床样本，充分展现了其在临床分子诊断领域的巨大应用潜力。