磷酸化蛋白检测避坑全指南：从样品到 WB 的硬核操作手册

你的磷酸化抗体，可能正在毁掉实验？

蛋白磷酸化作为信号通路研究的 "黄金指标"，其检测堪称科研人必修的 "显微镜级" 技术活。Western blot 虽为常规手段，但磷酸化检测的特殊性，让每个环节都藏着 "翻车风险"。今天就来拆解这套 "高难度动作" 的正确打开方式 --

一、解码样品：先摸清磷酸化蛋白的 "脾气"

磷酸化蛋白往往是细胞里的 "特殊玩家"，想让它们 "现身" 得用点巧劲：

刺激诱导有讲究：物理 / 化学刺激是激活磷酸化的常用手段，但时间和强度堪称 "玄学"-- 查文献 + 预实验是唯一捷径（比如某细胞因子可能需 37℃刺激 15 分钟才触发磷酸化）。

数据库助攻：PhosphoSitePlus 堪称 "磷酸化百科全书"，输入蛋白名称即可解锁其磷酸化位点、修饰频率等 "隐藏信息"。

对照双保险：阳性对照（已知磷酸化样本）和阴性对照（未刺激样本）必须配齐，否则抗体认没认错 "目标" 都难说！

二、蛋白提取：与时间赛跑的 "冰上芭蕾"

核心法则：快准冷 + 抑制剂护体

制样速度决定成败：

细胞洗涤用 4℃预冷 PBS，组织研磨请搬出液氮 "速冻"，全程让样品待在 "冰爽世界"，防止磷酸化 "转瞬即逝"。

抑制剂是 "守护神"：

裂解液必须现配现用，蛋白酶抑制剂 + 磷酸酶抑制剂是 "基础套餐"；若检测酪氨酸磷酸化，1μmol/L 原钒酸钠是 "隐藏菜单"。

划重点：部分磷酸化抗体明确禁止煮沸变性（会破坏磷酸化位点），上样前务必细读抗体说明书！

保存细节控：提取后的蛋白尽快分装成小份，-80℃冻存，反复冻融 = 让磷酸基团 "离家出走"。

三、内参双杀：破解磷酸化数据的 "密码本"

为什么别人的结果能发高分刊？可能赢在了内参设计：

总蛋白内参：比如检测 p-Akt，必须同时跑 Akt 总蛋白 -- 磷酸化 / 总蛋白的比值变化，才是真正的 "磷酸化水平证据"。

体系内参：Actin 或 GAPDH 是 "重量监督员"，确保每孔上样量一致，不然条带深浅可能只是 "上样误差的障眼法"。

四、WB 操作：磷酸化条带 "显影秘籍"

• 上样与抗体的 "剂量博弈"

磷酸化蛋白含量低？每孔可加到 30-50μg 蛋白（普通 WB 约 20μg），给抗体更多 "捕捉目标" 的机会。

抗体选优选斯达特：斯达特专有兔单B细胞抗体开发平台，重组兔单抗，特意性高，灵敏度高，稳定性强，批间一致性好，是您WB 最佳选择。

• 封闭与孵育的 "温度哲学"

封闭液选 5% BSA（TBST 配制），奶粉可能藏着磷酸酶 "内鬼"；封闭 1 小时刚刚好，太久会 "遮住" 抗原表位。

4℃孵育过夜是 "黄金操作"：低温让蛋白稳稳 "粘" 在膜上，避免高温导致的抗原脱落（PVDF 膜的物理吸附特性了解一下）。

• 洗膜的 "温柔艺术"

摇床转速别太猛，洗涤时间别太长 -- 磷酸化蛋白本就 "脆弱"，过度冲洗会让它们 "离家出走"。