生物制品宿主细胞蛋白（HCPs）残留：检测、法规与挑战

一、HCPs

在生物制品的生产过程中，宿主细胞扮演着关键的角色，是生产重组蛋白、抗体药物或疫苗药物等的重要起始材料。常见的宿主细胞类型涵盖了细菌细胞（如大肠杆菌）、酵母细胞（如酿酒酵母）以及哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和人胚胎肾（HEK）细胞）等。

然而，作为生物制品中的非目标成分，宿主细胞蛋白（HCPs）的残留问题不容忽视。HCPs 主要包括宿主细胞分泌的蛋白以及因细胞凋亡、代谢产生的部分结构蛋白。这些残留的 HCPs 具有潜在的安全风险，一方面可能诱导机体产生免疫应答，引发不良反应；另一方面，某些具有酶活性的 HCPs 还可能影响终产品中蛋白质的组成，进而对产品的稳定性造成威胁。

因此，HCPs 被视为生物制品的关键质量属性（CQA），在生物制品的成品和原液放行检测以及中间产品的工艺控制中都需要重点关注。即便经过复杂的纯化工艺，最终的生物制品中仍可能残留低浓度（1~100 ppm）的 HCPs，这凸显了建立有效检测方法的紧迫性。

二、法规引领

为确保生物制药产品的安全性、有效性和质量，各国监管机构对 HCPs 的控制制定了多层次、多方面的法规要求。

从国际法规来看，美国药典（USP）的 <1132> 章节明确规定，需采用灵敏度较高的方法检测药品中的 HCP，其含量应低于检测限，通常小于 100ppm（即 1mg 总蛋白中 HCP 含量应小于 100ng，也即 < 0.01%）。国际人用药品注册技术协调会（ICH）的 Q6B 指南指出，要依据 ICH 准则，运用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的 HCP，其残留量一般要求小于 100ppm。欧洲药典（EP）在 2.6.34 中规定，生物制品中 HCP 的含量应当小于 0.1%。

中国药典也对不同宿主细胞来源的生物制品中 HCP 残留量做出了明确规定：CHO 细胞来源的生物制品，HCP 残留需 < 0.05%（相当于小于 500ppm）；E.coli 来源的，HCP 残留需 < 0.01%（相当于小于 100 ppm）；假单胞菌来源的，HCP 残留需 < 0.02%（相当于小于 200 ppm）。其他国家和地区的药典也各自制定了相应的 HCP 残留标准，共同致力于保障生物制药产品的质量与安全。制药企业必须严格遵守这些法规要求，选择合适的检测方法和控制策略，确保 HCP 残留量处于可接受的范围之内。

三、检测手段

目前，测定生物制品中残留 HCPs 的方法丰富多样，主要可分为基于特异性抗体的方法和非免疫特异性方法。

（一）基于特异性抗体的方法

1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：作为目前 HCP 检测最常用的方法，ELISA 利用抗原抗体反应，通过标记的酶催化底物产生颜色变化来实现对 HCPs 的检测和定量。其优点显著，具有高灵敏度和特异性，能够检测到低至 ng/mL 级别的 HCPs；操作相对简单，适合大规模筛选且自动化程度高；还可以提供精确的 HCPs 浓度数据。然而，ELISA 也存在一定的局限性，它高度依赖特定的抗体，抗体的制备和验证成本高且耗时；对于某些 HCPs 可能缺乏合适的抗体，导致漏检；同时还可能存在抗体的交叉反应，影响检测的准确性。ELISA 主要应用于工艺开发中监测不同工艺步骤的 HCPs 水平，以及作为最终产品放行的关键检测方法，适用于需要高灵敏度和高通量的 HCPs 检测场景。

2. 免疫印迹（Western Blot）：该方法先将 SDS-PAGE 分离的蛋白质转移到膜上，再用特异性抗体检测目标 HCPs，通过化学发光或显色进行信号检测。免疫印迹的特异性高，能够针对特定 HCPs 进行检测，并提供定性和相对定量信息。但它操作复杂、耗时较长，适合小规模分析，且同样依赖特异性抗体，抗体制备和验证成本高，灵敏度也受到检测方法和抗体的限制。免疫印迹主要用于特定 HCPs 的检测，以确认和验证 ELISA 检测结果，以及在研发阶段对特定 HCPs 进行深入研究。

（二）非免疫特异性方法

1. 质谱分析（Mass Spectrometry, MS）：质谱通过电离样品分子，并依据其质量电荷比进行分离和检测，能够提供 HCPs 的定性和定量信息。其优点包括高灵敏度和分辨率，能检测和区分多种 HCPs；无需特定抗体，适用于未知或新发现的 HCPs；还能提供分子量、氨基酸序列等详细信息。但质谱分析操作复杂，样品制备和数据分析难度大，设备昂贵，需要高成本的仪器和技术支持，且分析时间长，更适合小规模、详细分析，不适用于高通量筛查。质谱主要应用于 HCPs 的鉴定，识别和定量复杂混合物中的 HCPs，以及在抗体开发中确认和验证 ELISA 抗体的靶标。

2. SDS-PAGE 结合蛋白质染色：此方法通过 SDS-PAGE 将蛋白质根据分子量分离，然后用染料（如考马斯亮蓝或银染）进行染色，以检测 HCPs 的总量和分布。它操作简单、成本低、设备要求低，能够直观可视化 HCPs 的分布和相对浓度。但该方法灵敏度低，仅能检测较高浓度的 HCPs（μg/mL 级别），难以提供精确的 HCPs 浓度，分辨率也有限，难以区分分子量相近的 HCPs。主要适用于初步筛选，快速评估 HCPs 的总量和大致分布，以及工艺监控中用于工艺优化和不同批次之间的比较。

3. 毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）：CE 通过毛细管内的电场分离蛋白质，依据电泳迁移率差异检测 HCPs。它具有高分辨率，能精确分离不同 HCPs，自动化程度高，适合高通量分析。但设备昂贵，需要高成本的设备和维护，技术要求高，样品制备复杂，分析时间较长，对某些 HCPs 可能灵敏度不够。主要应用于质量控制中进行详细的 HCPs 分析，以及工艺优化中用于监控生物制品生产过程。

4. 高效液相色谱（HPLC）：HPLC 通过液相色谱柱分离 HCPs，根据不同的保留时间进行检测和定量。它具有高灵敏度和分辨率，能分离和定量不同 HCPs，自动化程度高，适合定量分析。但设备昂贵，需要高成本的仪器和技术支持，样品制备复杂，时间长，分析速度较慢，且需要结合其他检测手段（如 MS）才能准确识别 HCPs。主要应用于质量控制中进行详细的 HCPs 分析和定量，以及研发阶段用于优化和监控生物制品生产过程。

5. 多种技术结合（如 ELISA 与 MS 结合）：综合利用 ELISA 和质谱等方法的优势进行 HCPs 的检测和分析，能够提高检测的灵敏度和准确性，提供更全面的 HCPs 信息。但操作复杂，需要多种设备和技术支持，时间和成本增加，技术要求高，需要多种技术人员的协同工作。主要应用于质量控制中确保最终产品的 HCPs 水平符合标准，以及工艺优化中用于工艺开发和优化阶段的全面 HCPs 分析。

四、未来展望

尽管 ELISA 是目前 HCPs 残留的主要质控方法，但它存在诸多局限性。其准确性高度依赖抗体的特异性，无法获得 HCPs 的种类及其含量分布信息，需要使用正交方法进行全面监测。例如，商业化的 HCP ELISA 试剂盒抗体特异性和适用性低，容易出现漏检，且更换批次时需再次验证。在单克隆抗体药物生产中，HCPs 残留可被蛋白 A 有效去除，但在基因治疗药物（如 AAV 和溶酶病毒等）生产中，缺乏相应的 HCPs 去除工艺，因此对于某些生物制品，结合多种检测方法分析和检测 HCPs 残留显得尤为重要。

为弥补 ELISA 的不足，液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）逐渐成为一种高通量、高灵敏度检测 HCPs 残留的方法。质谱法可在单次实验中鉴定和定量多种 HCPs，不存在抗体法对无亲和力或低亲和力 HCPs 的歧视，可应用于生物制品全生命周期的 HCPs 监控。此外，对于缺乏商品化 ELISA 试剂盒的宿主细胞，LC-MS 法的开发周期短，可在 1 个月内完成，能快速应用于残留 HCPs 的检测。

2023 年 5 月，美国药典发布的 "质谱法测定生物药中残留宿主细胞蛋白"(征求意见稿)，进一步推动和规范了 LC-MS 法在 HCP 分析检测中的应用，为未来 HCPs 检测技术的发展指明了方向。随着技术的不断进步，相信在 HCPs 检测领域将会取得更多的突破，为生物制品的质量和安全提供更有力的保障。