DNA 探针：分子检测领域的关键利器

DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获的DNA探针种类很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。

一、DNA 探针的来源与制备

1.基因组探针

基因组探针直接来源于基因组中的基因。它可以是完整的基因序列，包含了基因的全部遗传信息；也可能只是基因上的一段特定序列，这段序列往往具有独特的识别价值。在获取基因组探针时，通常依赖分子克隆技术。以细菌研究为例，由于细菌基因组庞大且复杂，包含众多基因，为获得特定细菌的特异性基因组探针，科研人员需要构建细菌基因组 DNA 文库。通过限制性内切酶对细菌 DNA 进行不完全水解，将其切成小片段后分别克隆，形成包含基因组全信息的克隆库。随后，利用多种其他菌种的 DNA 探针进行筛选，剔除产生杂交信号的克隆，最终得到的不与其他细菌杂交的克隆，就可能含有目标细菌特异性的 DNA 片段，这些片段便可作为基因组探针使用。

2.cDNA 探针

cDNA 探针的制备过程相对独特。它以相应基因转录产生的 mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下合成。与基因组探针不同，cDNA 探针不包含内含子序列，这使得它在检测特定基因表达时更加精准。因为内含子在基因表达调控中虽然具有重要作用，但对于直接检测基因转录后的表达产物 mRNA 而言，去除内含子可以避免不必要的干扰，使检测结果更加准确地反映基因的实际表达情况。

3.寡核苷酸探针

寡核苷酸探针是在体外通过机器人工合成的小片段单链 DNA，其长度一般在 20 - 50 个碱基左右。尽管它相对短小，但却具备独特的优势。寡核苷酸探针稳定性强，特异性极高，在极为严格的条件下进行杂交试验时，能够敏锐地检测出单个碱基的突变和错配情况。然而，由于其片段较短，携带的标记物数量有限，导致其敏感性相对较低。在实际应用中，科研人员会根据具体检测需求，合理选择寡核苷酸探针或其他类型的探针。

二、DNA 探针的显著优势

1.制备简便

DNA 探针大多克隆在质粒载体中，这种克隆方式使得 DNA 探针的制备过程相对简便。质粒作为一种常用的基因载体，具有自我复制能力和易于操作的特点。科研人员可以将目标 DNA 片段插入到质粒载体中，然后通过转化等技术将重组质粒导入合适的宿主细胞（如大肠杆菌）中。随着宿主细胞的生长繁殖，质粒载体携带的 DNA 探针也会大量复制，从而方便地获取大量的 DNA 探针，满足实验和检测的需求。

2.稳定性高

与 RNA 探针相比，DNA 探针具有更高的稳定性，能够有效抑制 DNA 酶的活性。在生物体内和体外实验环境中，核酸酶普遍存在，它们会对核酸分子进行降解，影响检测结果的准确性。RNA 探针由于其单链结构和核糖的化学性质，更容易受到 RNA 酶的攻击而降解。而 DNA 探针的双链结构以及脱氧核糖的稳定性，使其在面对 DNA 酶时具有更强的抵抗力，能够在较长时间内保持结构和功能的完整性，为实验的顺利进行提供了可靠保障。

3.标记成熟

DNA 探针的标记技术较为成熟，有同位素标记和非同位素标记两种主要方式，每种方式又包含多种具体的标记方法，为科研人员提供了丰富的选择。同位素标记的探针具有很高的放射比活性，这使得杂交检测的灵敏度极高，能够检测到微量的目标核酸序列。然而，同位素标记也存在一些局限性，如使用期限较短、具有放射性危害、污染物处置困难等，需要特殊的仪器设备和严格的防护措施，限制了其在普通实验室的应用。近年来，非同位素标记法得到了快速发展，像酶促标记法（如生物素、地高辛标记法）和化学标记法（如荧光生物素、酶标记法）等。这些非同位素标记的探针虽然在灵敏度上稍逊于同位素标记探针，但它们保存时间较长，且避免了同位素带来的污染问题，在实际应用中也得到了广泛的使用。

三、DNA 探针的标记技术详解

1.缺口平移法

缺口平移法是 DNA 探针标记中最常用的方法之一。该方法的反应体系主要包含 DNA 酶 I、大肠杆菌 DNA 聚合酶 I、三种三磷酸脱氧核糖核苷酸以及一种同位素标记的核苷酸（如 ³²P - dGTP）。在反应过程中，首先利用适当浓度的 DNA 酶 I 在探针 DNA 双链分子上随机切开若干个缺口，但并不会切断 DNA 或使其降解。接着，借助 DNA 聚合酶 I 的 5'→3' 外切酶活性，切去 5'末端的核苷酸；同时，利用其 5'→3'聚合酶活性，将 ³²P 标记的互补核苷酸补入缺口。这两种活性交替作用，使得缺口不断向 3'的方向移动，DNA 链上的核苷酸逐渐被 ³²P 标记的核苷酸所取代。最终，新合成的 DNA 链带有同位素标记，实现了对 DNA 探针的标记。

2.随机引物法

随机引物法的操作相对简便且高效。在变性的探针溶液中加入 6 个核苷酸的随机 DNA 小片段作为引物，这些引物能够与单链 DNA 的多个部位互补结合。然后，按照碱基互补原则，在引物的 3'-OH 端不断添加同位素标记的单核苷酸。通过这种方式，可以获得放射性比活性很高的 DNA 探针。随机引物法的优势在于，它不受 DNA 模板序列的限制，能够在多种不同的 DNA 模板上进行标记，适用于各种复杂的基因检测场景。

3.末端标记法

末端标记法与前两种方法不同，它并非对 DNA 进行全长标记，而是只在其 5' 端或 3'端导入标记物进行部分标记。具体操作时，先利用限制性内切酶将完整双链 DNA 切割成具有末端突出的 DNA 片段，然后使用 Klenow DNA 聚合酶和 α - ³²P - dNTP 对末端进行标记。这种标记方法的优点是可以得到全长 DNA 探针，但由于携带的标记分子较少，标记比活性相对不高。在一些对标记比活性要求不高，但需要保留 DNA 全长信息的实验中，末端标记法具有独特的应用价值。