Protocol | 体外/离体生成抗原特异性CTL

体外生成的人细胞毒性T淋巴细胞（CTL），不仅可用于评估个体的内在CD8+ T细胞反应，还可用于筛选可作为过继免疫治疗候选者的免疫原性抗原。扩增CTL的体外方法需要将初始T细胞与作为刺激细胞的抗原呈递细胞（APC）共同培养，这些细胞表达特定的抗原。这里，描述了针对由单核细胞衍生的树突状细胞（DCs）呈递的目标抗原生成CTL的protocol。

CTL是能够以I类MHC限制的方式杀伤表达靶抗原的靶细胞的淋巴细胞。它们通常是CD8+ T细胞，在宿主对病毒感染细胞、器官移植和癌细胞的反应中起到效应作用。效应CTL由初始T细胞生成，这些初始T细胞在被APC刺激后分化为效应（"杀手"）细胞。可以通过使用抗CD3抗体在体外扩增CTL，该抗体通过与TCR复合物结合来实现对T细胞群的多克隆刺激。然而，这种方法虽然可以测量效应T细胞的细胞毒活性，但不具备抗原特异性。这里描述了一种通过用负载靶抗原的单核细胞衍生DC刺激来在体外扩增抗原特异性CTL的方案。此方法不仅可用于生理条件下测量效应T细胞的细胞溶解能力，还可用于评估靶抗原的免疫原性潜力，这些抗原可能适用于免疫治疗策略。

已描述了多种生成单核细胞衍生DC的方案，这些方案使用不同类型的培养基、血清和细胞因子组合。在此，是一种传统方案，该方案需要将单核细胞与rGM-CSF和rIL-4共培养6天，随后用细胞因子成熟混合物（即IL-1β、TNF-α、IL-6和PGE2）再处理2天。由此生成的DC表现出完全成熟的表面表型，并表达成熟标志物（CD80、CD83、CD86和CCR7）。为了作为抗原呈递细胞（APC）发挥作用，DC必须装载多种形式的抗原，例如肽段抗原、肿瘤裂解物、凋亡的肿瘤细胞、抗原性DNA和mRNA。在癌症背景下，用肿瘤裂解物装载DC可实现对多个免疫原性CTL表位的处理，且APC会呈递与自身MHC分子匹配的肽段。这里，以一种用HLA-A2限制性肽脉冲DC的程序为例，这些DC将用于持续2-3周的多轮T细胞刺激，如图1所示。通过该方案生成的抗原特异性T细胞主要为CD8+细胞毒性T细胞，并将用于不同的下游应用，例如蛋白质和基因表达谱分析。当然，作为APC细胞的DC，也可使用工程化的HLA细胞系，例如T2细胞、K562细胞等。

图1 CTLs生成实验的流程图。生成CD8+ CTLs首先需要从外周血中分离PBMCs。细胞的贴壁部分（单核细胞）将被培养8天以生成成熟的DCs，而非贴壁的T细胞则会被冷冻保存。在用肽脉冲处理DC后，解冻T细胞并用DC进行多轮刺激。经过14天或21天的培养后，通过免疫磁珠技术分离CD8+ T细胞，并检测其细胞毒性功能状态。

一、外周血单个核细胞（PBMC）的分离

所有与细胞和人体血液接触的溶液和设备必须是无菌的，并应相应地使用无菌操作程序。

1. 用1× PBS pH7.4加1mM EDTA按1:2比例稀释新鲜肝素抗凝血，并混合均匀（见注释1）。

2. 将12ml Ficoll-Hypaque溶液分别加入三个50ml圆底离心管中，轻轻将30ml稀释后的血液缓慢叠加到Ficoll上层，形成两个分离的层次。

3. 在室温下以460×g离心25min，不设间歇。

4. 使用无菌移液器收集界面层的白细胞，并将其转移到另一个50ml离心管中，直至达到25ml。尽量避免吸入血浆和Ficoll-Hypaque。

5. 用PBS将细胞悬液在每个管中补至50ml进行清洗，然后在4°C下以250×g离心12min（见注释2）。

6. 弃去上清液，用PBS重悬细胞，并重复清洗步骤，在4°C下以175×g离心10min（见注释3）。

7. 去除上清液，用10ml冷PBS重悬细胞，并计数细胞（见注释4）。在计数的同时，以450×g的转速在4°C下离心细胞悬液5min。

二、从非粘附性T细胞中分离单核细胞

在此阶段，收集的PBMC包含两种细胞群：淋巴细胞和单核细胞。由于单核细胞CD14+能够黏附于培养瓶的塑料表面，因此可以将其从淋巴细胞中分离出来，并将它们分化为DC。非黏附性的T细胞将会被冷冻保存，以便用于下一步的体外刺激实验。

1. 将细胞重悬于细胞培养基（AIMV）中，使细胞浓度达到10×10^6个细胞/ml（见注释5）。

2. 在T75培养瓶中，将90-100×10^6个细胞以10ml AIMV的总体积进行转移（见注释6）。

3. 将细胞置于37°C下孵育1-2h，孵育期间避免移动培养瓶，以便单核细胞能够贴壁。

4. 孵育完成后，取出培养瓶并收集含T细胞的上清液（见注释7）。

5. 使用室温下的PBS（不含EDTA），以每次10ml的量洗涤培养瓶两次（见注释8）。

6. 在4°C下以450×g离心5 min。

7. 完全弃去上清液，并将细胞冻存在FBS/DMSO中（见注释9）。

三、从单核细胞生成DC

以下是生成成熟的单核细胞衍生树突状细胞（mDCs）的标准程序。该程序基于广泛使用的两步培养法。第一步是将单核细胞与GM-CSF和IL-4共同培养5天。由此产生的未成熟DCs会被添加含有IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE-2的细胞因子混合物诱导成熟，以获得激活/成熟DC的典型特征。为了作为抗原呈递细胞发挥作用，DC必须加载抗原。

1. 向贴壁单核细胞培养瓶中加入10ml未成熟DC培养基（含重组人GM-CSF（1000 U/ml）和IL-4（1000 U/ml）的AIM-V培养基）（见注释10）。

2. 在37°C和5% CO2条件下孵育6天。

3. 孵育第3天后，向培养物中每T75培养瓶加入3ml新鲜DC培养基。

4. 第6天时，将培养瓶中的所有培养基移除，并用10ml室温PBS进行两次清洗。

5. 加入含有IL-1β（25 ng/ml）、TNF-α（50 ng/ml）、IL-6（1000 U/ml）和PGE2（10^-6 mol/L）的10ml DC培养基，于37°C和5% CO2条件下孵育48h（见注释11）。

6. 48h后，用冷PBS从培养瓶中分离mDCs。检查mDCs是否已从塑料表面脱落。如果没有，尝试轻轻敲击培养瓶。

7. 将细胞悬液转移到50ml试管中，并计数细胞。取出50万个细胞进行生成的DC的流式分析（见注释12）。

8. 在计数的同时以450×g离心5min，并准备三份DCs的等分样本。

9. 冻存两份等分样本用于第二次和第三次刺激（见注释13）。

10. 使用第一份等分DCs进行肽加载。

四、用肽脉冲处理mDCs

肽段应为8-10个氨基酸长，并且能够结合HLA-A2肽域，以便评估HLA-A2阳性个体中的内在CTL反应。因此，在开始之前，需要通过使用特定单克隆抗体对PBMC进行流式细胞术分析来确定HLA-A2阳性的供体。

1. 用AIM-V洗涤两次mDCs，然后将细胞重悬于AIM-V中，浓度为每孔0.5-1×10^6/1.5ml，置于6孔培养板中。

2. 加入所需的HLA-A2限制性肽，使其终浓度达到10μg/ml（见注释14）。

3. 加入β2m，使其终浓度达到3μg/ml（储备液浓度1mg/ml）。

4. 在37°C和5% CO2条件下孵育最佳时间（通常为2-4h），期间偶尔摇动。

5. 用AIMV洗涤细胞两次，并重悬于2ml T细胞培养基中。

五、体外生成抗原特异性CTL

体外刺激mDCs可以使用新鲜或冷冻保存的外周血T淋巴细胞进行。

1. 将T细胞重悬于T细胞培养基中，并调整浓度至10-20×10^6个细胞/ml。应答T细胞与DC的比例为 20:1 至 30:1（见注释15）。

2. 在6孔培养板的每孔中加入3ml T细胞悬液，最多至每孔5ml（6孔板）。用5ml PBS填充空孔以平衡系统。

3. 在37°C和5% CO2条件下孵育1周（见注释16）。

4. 第7天时，解冻第二份mDCs并按照首次刺激的方法重复刺激T细胞。

5. 加入rhIL-7 [5 ng/ml] 和rhIL-2 [20 U/ml]。

6. 第14天时，解冻第三份mDCs并按照首次和第二次刺激的方式重复刺激T细胞。

7. 加入rhIL-7 [5 ng/ml] 和rhIL-2 [20 U/ml]。

8. 第21天，使用MACS磁珠（Miltenyi Biotec）通过阴性选择在MiniMACS柱上从大量T细胞培养物中分离CD8+ T细胞，操作步骤按照制造商的协议进行，分离得到的细胞可用于评估CTL活性或进行基因和蛋白表达分析，可用荧光标记的pHLA-Tetramer流式检测该刺激抗原的特异性T细胞。若流式染色分析确认获得到该pHLA特异性T细胞，后续可对该T细胞进行测序进一步获得该pHLA特异性的TCR序列，可能适用于细胞免疫治疗策略。

注释：

1. 如果从白细胞层开始，血液应按1:3的比例用PBS/1 mM EDTA稀释。

2. 先将细胞沉淀重悬于少量液体中，然后再加入更多液体。否则细胞会形成"团块"。

3. 如果上清液结果仍然浑浊，请重复此步骤。你应该能够清楚地看到50ml管另一侧的刻度标记。

4. 可使用细胞计数仪、流式细胞仪等方法，若使用台盼蓝人工计数，在Eppendorf管中加入10μl的台盼蓝和10μl的细胞悬浮液，充分混匀后，将10μl染色悬浮液置于计数室（Fd=2）。使用以下公式：nº细胞 = M / 4×Fd×V×10^4。M=计数四个方格后总细胞数。Fd=使用台盼蓝的稀释倍数（在这里的情况下为2）。10^4=计数室的稀释倍数。V=细胞所处的重悬液体积（在这里的情况下为10ml）。

5. 也可以通过MACS系统使用阴性选择获得CD14+单核细胞。尽管该系统无疑更快，但抽提这样的细胞可能不是最经济的时间利用方式。

6. 为了获得高产量和高纯度的DCs，以最佳浓度将细胞接种在培养瓶中非常重要。请考虑以下比例：

- 在T75培养瓶中，90-100×10^6个PBMCs置于10ml AIMV中。

- 在T25培养瓶中，25-30×10^6个PBMCs置于4ml AIMV中。

- 在T150培养瓶中，180-200×10^6个PBMCs置于18ml AIMV中。

如果接种的细胞数量超过推荐数量，则存在并非所有单核细胞都能贴附于培养瓶的风险。这将导致DC产量较低，并且非贴壁T细胞群中也会包含单核细胞。

7. 在收获上清液之前，先用显微镜观察细胞。贴壁的单核细胞看起来像"压平的变形虫"。如果你还没有看到这种形态，可以让细胞继续孵育更长时间，并每半小时检查一次。

8. 在此阶段，建议取出一小份样本进行流式细胞术分析，以研究新分离的T细胞的功能和表型特征。

9. 用冷冻保存液（90% FBS/10% DMSO）将细胞重悬至最高浓度为1×10^7细胞/ml。标记不同的冷冻管，注明样本名称、日期和细胞数量。将分装好的样本转移到冷冻管中，并在加入冷冻保存液后的10min内放入-80°C冰柜中的冷冻容器中。

10. 可以使用500 U/ml浓度的GM-CSF。

11. 尽管大多数"传统"的mDCs生成方案需要8天培养时间，但发现一种更快的方案：通过使用GM-CSF（1000 U/ml）和天然IFN-α（Intron A-IFN-α2b，8000 U/ml）培养贴壁单核细胞仅3天，可以诱导出更强的CTL活性。此类DC表现出"中间成熟"表型，在形态上与经典的DC有所不同。使用"快速DC"的优势在于能够显著节省时间和成本（尤其是与细胞因子相关的成本）用于DC的生产。

12. 用荧光标记的单克隆抗体（mAb）对人细胞鉴定标志物（CD14、CD123、CD11c）、共刺激标志物（CD40、CD80、CD86）、成熟和抗原提呈分子（CD1a、CD83、DC-LAMP、HLA-DR、HLA-ABC）以及细胞因子受体（CCR7和CCR5）染色的mDCs。将细胞（1×10^5）重悬于 90μl 的FACS buffer（PBS、0.5% BSA 和 0.02%氮化钠）中，与适当的荧光标记mAbs在4°C下孵育15min。孵育后，用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并重悬于 0.5ml PBS中。

13. 由于此方法需要长期细胞培养和多次操作，污染是这类培养中的常见问题。因此，强烈建议对每种细胞类型的不同等分样本（即DC或新分离的非粘附性T细胞）进行冷冻保存。

14. 肽溶解于DMSO中，浓度为10mg/ml，并储存于-20°C长期保存。短期肽存储（<1 个月）建议在4°C进行。

15. 通常，T细胞与mDCs的比例范围为 20:1 至 30:1。每种donor的理想DCs与T细胞比例应进行滴定测定。最佳比例可能因刺激类型而异，例如抗原对比肿瘤裂解物或抗CD3加抗CD28刺激。

16. 在此孵育期间，每天检查培养基的颜色变化。如果发生颜色变化，先尝试简单地添加新鲜培养基，每孔最多加至8ml；或者缓慢从孔的侧壁吸出培养基（避免扰动底部的细胞），并将废液弃掉。如果细胞已达到高密度，轻轻混匀孔中的细胞，并均等地分配到两个孔中。所有情况下，需在孔中添加新鲜培养基。

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