创新性纳米囊泡，为作物保护提供新方向

文章题目：Extracellular Vesicles Mimetic Design of Membrane Chimeric Nanovesicles for dsRNA Delivery in Spray-Induced Gene Silencing for Crop Protection

期刊：ACS Nano

影响因子：15.8

文章简介

喷雾诱导基因沉默(Spray-induced gene silencing, SIGS)是一种基于RNA干扰(RNAi)的作物保护策略，它通过直接喷洒目标特异性的双链RNA(dsRNA)到植物表面来杀死病原体并预防疾病。然而，由于某些病原体对dsRNA的摄取能力有限，以及dsRNA在环境中的不稳定性，SIGS的应用面临挑战。

2024年11月12日，大连理工大学生物工程学院杨君教授团队与中国农业科学院农业基因组研究所杨青研究员团队合作，在ACS Nano(IF=15.8)上发表了题为Extracellular Vesicles Mimetic Design of Membrane Chimeric Nanovesicles for dsRNA Delivery in Spray-Induced Gene Silencing for Crop Protection的研究文章，研究引入了创新的仿生纳米囊泡(ECNs)，它是通过冻融法利用番茄叶细胞膜和阳离子脂质体组装而成，与细胞间核酸运输中细胞外囊泡的功能类似，ECNs作为一种混合纳米系统，克服了在致病疫霉中递送外源dsRNA的挑战。研究发现，ECNs在作物保护方面的优势更加明显，包括对dsRNA的高负载和保护、提高生物安全性以及高效内化到病原体和植物细胞中，均显著提高了RNAi在预防致病疫霉对易感番茄植株早期感染方面的功效。

技术路线

研究结论

1. ECNs的制备与表征

研究人员开发了一种简单的冻融方法来制备ECNs，那就是将源自番茄叶片的细胞膜整合到STE（sterosomes甾醇体，一种非磷脂阳离子脂质体）成分中。为了形成稳定的ECNs，研究人员首先需要对STE中细胞膜（所有蛋白质浓度）的量的占比进行优化，他们使用香豆素6(C6)标记的STE膜（STEsC6）、DiO或DiD标记的源自叶片的细胞膜（叶片膜DiO/DiD）进行了荧光共振能量转移(FRET)和纳米颗粒追踪分析(NTA)，结果发现在1.4:100和2.4:100的比例下，不同成分之间的融合更成功（图1A-D），基于上述的实验结果，研究人员为后续的实验选择了1.4:100的最佳质量比，在这个质量比下有70.4%的颗粒呈现C6和DiD的双信号响应，真实融合效率为13.2%，单个ECN颗粒上黄色和红色荧光信号的共定位数据验证了这种占比下不同成分间融合的更成功（图1E-H）

图1. ECNs的制备与鉴定

为了评估ECNs的稳定性，研究人员将STEs和ECNs在室温下放置两个月，放置期间未检测到显著变化，表明ECNs具有和STEs相当的长期稳定性。随后作者利用蛋白质组学分析对叶提取物进行鉴定，结果共鉴定出3469种蛋白质，其中ECNs具有3386种；在蛋白质类型和丰度分布方面，STEs和ECNs两组之间未观察到显著变化，表明了叶提取物中的蛋白质得到了很好的保留，对ECNs没有污染；然而与叶提取物相比，ECNs中的大多数蛋白质的相对丰度出现下调，下调表明了这些蛋白质在制备过程中可能不够稳定（图2A-D）。

图2.ECNs稳定性鉴定

2. 将双链RNA(dsRNA)装载到ECNs上

为了测试ECNs加载不同长度dsRNA的能力，研究人员进行了凝胶电泳，随后针对作物早期感染生物营养生长阶段的一个标志物--P.infestans（疫霉菌）的吸器膜蛋白(Hmp)，制备了双链HMP1(dsHMP1)载体；结果表明，STEs和ECNs都能够装载带负电荷的dsHMP1，由于装载dsHMP1后ECNs的ζ电位降低，判定其结合能力主要是由于静电相互作用，进一步确定显示dsHMP1在ECNs中装载的最佳质量比为30:600(w/w)，流体动力学尺寸为403.3±6.76nm(0.21±0.04 PDI)，而STEs - dsHMP1的流体动力学尺寸则为185.1±2.35nm(0.26±0.03 PDI)（图3A-C）。

由于自然界中普遍存在的核糖核酸酶，mRNA在室温下非常容易降解，这一现象阻碍了基于RNA抑制的农药在开放自然环境中的应用，基于上述背景，研究人员同时测定了ECNs对dsRNA的保护稳定性。当使用纳米载体时，不同时间间隔核酸酶处理的泳道中，仅观察到极少量未结合的dsRNA逸出，这个数据为STEs和ECNs都能防止dsRNA降解提供了强有力的证明（图3D）。

图3. 将双链RNA（ds_RNA）装载到ECNs上

3. ECNs具有较高的叶片粘附能力和作物安全性能

由于自然界环境的不稳定，在粉尘漂移和雨水淋溶之后，生物靶标对喷洒在作物表面农作药物的实际利用率仅不到0.1%，在此背景下，纳米载体附着于叶片的能力对SIGS有重要影响性。

已知较大的接触角不利于溶液在叶片上的铺展和留存，因此研究人员通过测量接触角来确定STEs和ECNs对叶表面的亲和力，实验结果显示，对照组Tris-缓冲溶表现出较差的亲水性（图4A），然而经过十次冲洗后，施用于番茄叶的STEsC6和ECNsC6液滴在叶片两面均表现出优异的留存性（图4B），此外将STEs和ECNs直接喷洒在番茄(Solanum lycopersicum)和黄瓜(Cucumis sativus)幼苗上对其进行植物毒性实验，结果发现STEs和ECNs对番茄叶均没有造成任何明显的毒性或不良影响，然而STEs对黄瓜幼苗却造成了一定的毒性损伤（图4C-D），而含有天然细胞膜成分的ECN悬浮液即使在600mg/L的高浓度下对黄瓜幼苗也没有作物毒性损伤，这些结果表明ECNs是更安全、更环保的纳米载体，从而有可能拓宽其在SIGS领域的应用。

图4. ECNs具有较高的叶片粘附能力和作物安全性能

4. ECNs-dsHMP1对致病疫霉和番茄叶片的递送效率

致病疫霉的双链RNA摄取效率较低，裸双链RNA无法抑制其毒力，这一直是RNAi介导的植物免疫(SIGS)的主要障碍。为了观察摄取过程，研究人员利用双链RNA荧光标记物(dsRNAU)通过荧光显微镜(CFM)追踪其在致病疫霉中的位置，结果显示由于ECNs装载的外源dsRNA分子可以被递送至细胞而不引起任何不良影响，且在致病疫霉的孢子囊、游动孢子和菌丝体中均检测到显著的荧光信号，表明ECNs-dsRNAU具有有效的dsRNA递送能力（图5A）。

图5. ECNs-dsHMP1对致病疫霉和番茄叶片的递送效率

5. ECNs-dsHMP1干扰病原体感染

为了在致病疫霉中实现有效的RNA干扰，研究人员选择了疫霉属物种中生物营养生长标志物-编码吸膜器蛋白的Hmp1基因作为靶标，将负载dsHMP1和dseGFP的STEs/ECNs的SIGS应用作为非靶标对照。实验显示，Hmp1的两种表达在在叶片感染后2天(dpi)都较高，并在5 dpi时下降，在土豆作物中也得到了类似的结果，然而纳米载体(STEs/ECNs)处理对感染进程几乎没有影响，这从叶片上原位可见的明显深褐色病斑以及定量的生物量可以观察到（图6A-B）。非靶标组(STEs-dseGFP，ECNs-dseGFP)对致病疫霉的传播没有显示出显著的抑制作用。相反，ECNs-dsHMP1表现出明显的抗感染作用，阻止了病斑面积的扩大，并减少了紫外(UV)光下的叶片损伤。

为了进一步测量相对表达水平，研究人员使用实时定量PCR(RT- qPCR)来量化感染番茄叶片中Pi-HMP1的表达，并选择Pi-β-肌动蛋白作为内参。与对照样品相比，STEs-dsHMP1和ECNs-dsHMP1处理都表现出强烈的基因沉默（图6C-D），这表明裸露的dsHMP1不能进入致病疫霉，并且单独的STEs/ECNs不会引起Pi-HMP1表达水平的任何变化，而STEs/ECNs-dsHMP1缺乏导致Pi-HMP1的相对表达水平急剧下降，表明在感染早期成功使得内源基因抑制，进一步验证了STEs/ECNs - dsHMP1对病原体RNA表达的抑制效果。

图6. ECNs-dsHMP1干扰病原体感染

研究结论

该研究中，研究人员合成了一种模拟细胞外囊泡的嵌合纳米囊泡(ECNs)，它可以将双链RNA高效递送至病原体和植物体中，研究人员通过将叶细胞膜添加到阳离子甾醇体(STEs)中，成功制备了这种高度稳定的纳米囊泡，不仅可以更好地装载和保护RNA分子、还能够提高生物安全性以及促进病原体摄取及其被植物内化，且研究人员通过靶向增强双链HMP1递送的实验，发现ECNs-双链HMP1成功降低了感染作物叶片中Hmp1的相对表达水平，进一步验证了ECNs的功效。

总体而言，ECNs的发现为基于RNA-抑制保护作物的生物农药领域提供了有效且可持续的指导。

打赏