细菌内毒素检测技术综述

细菌内毒素（Bacterial Endotoxin）是革兰氏阴性细菌细胞壁裂解后释放的毒素，其主要成分为脂多糖（LPS）。脂多糖主要由特异性多糖、非特异性核心多糖和类脂A组成。类脂A又称脂质A，是内毒素生物活性或毒性反应的主要基团。在细菌生长、分裂、死亡和溶解过程中，内毒素将释放到周围环境，进入血液或脑脊液时会引起机体发热，因此也称为热原（Pyrogen）[1]。

革兰氏阴性菌在自然界中广泛存在，人们可从医疗器械、注射药物、水或任何与患者血液接触的物体中接触到细菌内毒素。细菌内毒性质稳定，普通高温处理亦无法破坏其生物学毒性，难以去除。从临床角度看，人体对于细菌内毒素极为敏感，作为一种强有力的免疫系统刺激物，即使是极微量的内毒素也能引发人体发烧、炎症，乃至致命性的脓毒症、脓毒性休克和多器官衰竭等全身性疾病[2]。由于细菌内毒素分布范围广、性质稳定、极易穿透常规的除菌滤膜，且医疗器械制造或药品生产过程中的高压蒸汽灭菌、辐照和气体灭菌能够杀灭细菌，但不能灭活内毒素，因此难以预防细菌内毒素污染。

在医疗保健领域，无菌操作是确保药品和医疗器械安全性的关键前提，细菌内毒素检测则作为评估无菌产品安全性的重要技术手段，在生物制药、医疗器械制造乃至食品工业中扮演着至关重要的角色，对于保障产品质量和维护消费者健康至关重要。尽管医疗器械在疾病的诊断、预防、监测、治疗和缓解方面得到了广泛应用，但国内外因医疗器械细菌内毒素超标引发的不良事件和产品召回仍然时有发生。例如，2021年美敦力公司因部分小儿氧合系统产品细菌内毒素超标而主动召回了已发售的产品。美国食品药品监督管理局（FDA）公布的GMP调查结果显示，在因细菌内毒素相关问题被召回的产品中，医疗器械占到了95%，表明医疗器械的细菌内毒素检测是医疗器械监管工作中的一个关键环节[3]。因此，所有用于注射、植入或与血液直接接触的产品，尤其是那些直接接触血液或无菌部位的器械，如注射器、导管、心脏瓣膜等，都必须经过严格的内毒素检测，以确保它们不会对患者产生不良反应。

内毒检测在保障产品安全及产品合规性要求极为重要，各国药典均收录了细菌内毒素检查的相关方法[4-6]，如美国药典USP <85> 、欧洲药典EP 2.6.14 、中国药典（ChP）2020版1103。概括说来，细菌内毒素检查法主要包括家兔热原检查法（RPT）、细菌内毒素法 (BET) 或鲎变形细胞裂解物（LAL）测定法、重组因子C（rFC）检查法、单核细胞活化反应测定法（MAT）。

1. 家兔热原检查法（Rabbit pyrogen test，RPT）

家兔热原检查法，系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，监测家兔的体温升高情况，以判断供试品的热原限度是否符合规定，检测灵敏度可达0.5 EU·mL-1。其原理是内毒素作用于哺乳动物的中枢神经系统，引起体温升高。RPT起源于20 世纪初，标志着热原检测技术的初步形成。此法优点是能客观反映供试品在动物体内引起的发热情况，但存在成本高、操作复杂、实验周期长、灵敏度低、个体差异大、重现性差、易造成试验结果假阳性或假阴性等缺点。

2. 细菌内毒素检查法（Bacterial endotoxin test，BET）

细菌内毒素检查法，也称鲎试剂法（limulus amebocyte lysate，LAL/tachypleus amebocyte lysate，TAL），系利用鲎变形细胞裂解物来检测或量化内毒素限量是否符合规定的方法，其反应机理是细菌内毒素在二价阳离子参与下特异性激活酶原ProC而引起的一系列级联反应。细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法。

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性或半定量检测内毒素，此法最低检测限为0.03 EU·mL-1。其优点为操作简单、结果直观，但灵敏度低、易受干扰、易受人为判断影响。

光度测定法又分为浊度法与显色基质法。浊度法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中浊度变化来检测内毒素含量，根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。此法检测范围为 0.006~300 EU·mL-1。其优点为自动化程度高、灵敏度高、线性检测范围广，可准确定量，但易受(1-3)-β-D-葡聚糖的干扰，产生假阳性的结果。

显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测值增加速度的方法。显色基质法是级联反应后的凝固酶与显色底物反应，通过测量吸光度A 545 nm来检测内毒素含量，此法最低检测限为0.002 EU·mL-1。其优点为灵敏度高、定量精确、成本较高，但操作较为复杂、需要特定的检测仪器。

3. 重组C因子（rFC）检查法（Recombinant Factor C，rFC）

重组C因子法是利用重组C因子试剂与内毒素反应过程中的荧光信号变化而测定内毒素含量的方法，重组C因子与细菌内毒素结合后被激活，由无活性的蛋白酶原转变成具有生物活性的蛋白酶，识别并催化下游荧光底物产生荧光信号，荧光信号的强度和内毒素浓度成正比，其检测范围为0.005 ~5 EU·mL-1[7]。《中国药典》（2020年版）和《美国药典》均收录并确定 rFC 检测法为内毒素检测替代方法。2021 年《欧洲药典》2.6.32 章正式收录 rFC 检测法作为内毒素检查法之一[8]。此法灵敏度高、操作便捷、成本低、干扰少、专属性高、准确度和重现性高，但需要使用特定的仪器（荧光酶标仪，激发/发射波长为380nm/440nm）。

4. 单核细胞活化反应测定法（Monocyte activation test，MAT）

单核细胞活化反应测定法，系利用单核细胞或单核细胞系模拟人体，以人源促炎症细胞因子（如IL-6、IL-1、TNF-a)为标记物来定量检测供试品中细菌内毒素等热原物质。在医疗器械行业，MAT 已有对应的行业标准《YY/T 1500-2016 医疗器械热原试验 单核细胞激活试验 人全血 ELISA 法》[9]，《中国药典》2020年版"9301 注射剂安全性检查应用指导原则"中也收录了单核细胞活化反应测定法作为热原检查的补充方法。此法可以消除种间差异，确定内毒素热原和非内毒素热原。然而人血制剂昂贵且商业化难度高、生化污染、不适用于本身能刺激或抑制单核细胞促炎症因子的释放以及对细胞增殖有明显影响的供试品。

既往的细菌内毒素检测方法均存在局限性，家兔热原检查法虽然仍在使用，但其高昂的实验成本、漫长的周期以及涉及的动物福利和伦理问题，在国外逐渐被淘汰。随着科技的发展，新型的细菌内毒素检测技术如基于荧光探针和生物酶的生化传感器法，正在迅速发展[10]。目前，鲎试剂法因其灵敏性、特异性、准确性和成本效益仍是主流的细菌内毒素检测方法。重组C因子法作为补充方法，不仅有助于保护环境和减缓鲎资源的消耗，而且不存在G因子旁路干扰，具有更高的专一性，目前rFc法在医疗器械领域已有拟定了行业标准《YY/T 1939-2024 医疗器械细菌内毒素试验方法重组 C 因子法》即将发布实施，预计随着技术的成熟和新标准、法规的实施，rFC检测法在医疗器械检测领域的应用和推广将会增加，有望成为细菌内毒素检测的常规技术手段，提高医疗器械细菌内毒素检查的准确性，减少医疗器械不良反应事件的发生，也更有利的保障人类生命健康。

参考文献：

[1] Christian R, Chris W. Lipopolysaccharide endotoxins[J]. Annual Review of Biochemistry, 2002, 71(1): 635-700.

[2] Zhang C , Tian F, Zhang M , et al . Endotoxin contamination, a potentially important inflammation factor in water and wastewater: A review[J]. Sci Total Environ, 2019(681): 365-378

[3] Tidswell EC. A Nontrivial Analysis of Patient Safety Risk from Parenteral Drug- and Medical Device-Borne Endotoxin[J]. Drugs R D, 2023, 23(1): 65-76.

[4] Su WQ, Ding XT. Methods of Endotoxin Detection[J]. J Lab Autom, 2015, 20(4): 354-364.

[5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020.

[6] 美国药典委员会 . 美国药典：国家处方集 [M]. 北京：化学工业出版社，2013.

[7] 国家药品监督管理局 . 医疗器械细菌内毒素试验方法重组 C 因子法：YY/T 1939-2024[S]. 北京：中国标准出版社，2024.

[8] 国家食品药品监督管理总局. 医疗器械热原试验单核细胞激活试验人全血 ELISA 法：YY/T 1500- 2016[S]. 北京：中国标准出版社，2016.

[9] Baker E, Ponder J, Oberdorfer J, et al. Barriers to the use of recombinant bacterial endotoxins test methods in parenteral drug, vaccine and device safety testing[J]. Altern Lab Anim, 2023, 51(6): 401-410.

[10] Lim S K, Chen P, Lee F L, et al. Peptide-assembled graphene oxide as a fluorescent turn-on sensor for lipopolysaccharide (endotoxin) detection[J]. Analytical Chemistry, 2015, 87(18): 9408-9412.

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