ALKBH5通过神经胶质瘤中的m6A依赖性机制促进肿瘤进展

神经胶质瘤是成人中枢神经系统中最常见的恶性原发性肿瘤，预后极差。尽管采用多模式治疗，但复发和恶性进展是低级别胶质瘤治疗的主要难题。表观遗传调控在肿瘤发生中起着重要作用，其中m6A修饰是最丰富的mRNA修饰之一，与多种癌症的发生发展密切相关。然而，ALKBH5（一种m6A去甲基化酶）在神经胶质瘤中的作用尚不清楚。

近日，南方医科大学珠江医院郭洪波教授团队探讨了ALKBH5在神经胶质瘤进展中的功能及其作为治疗靶点的潜力。研究人员利用MeRIP-seq揭示了ALKBH5在神经胶质瘤中的重要作用，特别是其通过m6A修饰调控FOXO1表达的分子机制。这些发现为神经胶质瘤的治疗提供了新的潜在靶点，即通过抑制ALKBHH5或恢复FOXO1的功能来抑制肿瘤的恶性进展。相关研究成果以《ALKBH5 facilitates tumor progression via an m6A-YTHDC1-dependent mechanism in glioma》为题发表于《Cancer Letters》期刊。

标题：ALKBH5 facilitates tumor progression via an m6A-YTHDC1-dependent mechanism in glioma（ALKBH5 通过神经胶质瘤中的 m6A-YTHDC1 依赖性机制促进肿瘤进展）

发表期刊：Cancer Letters

影响因子： IF 9.1/1区

技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq等

本研究结果揭示了ALKBH5在胶质瘤中的表达显著增加，且ALKBH5过表达预示着预后不良。ALKBH5过表达在体外促进细胞增殖、迁移和侵袭，并在体内加速了肿瘤生长。此外，通过m6A-MeRIP-seq、MeRIP-qPCR、RNA pulldown和免疫沉淀实验，研究人员发现转录因子叉头框蛋白O1（FOXO1）是ALKBH5的潜在靶点。从机制上讲，ALKBH5通过去甲基化修饰m6A的FOXO1 mRNA，破坏FOXO1的稳定性和表达，这一过程依赖于YTHDC1通路。下调的FOXO1与β-catenin相互作用，增加了其在细胞核中的积累，从而促进了致癌的Wnt/β-catenin信号通路。本研究结果表明，靶向ALKBH5/FOXO1轴可能为胶质瘤治疗提供一种新的治疗策略。

研究亮点

ALKBH5在胶质瘤中表达上调，并预示着预后不良。

ALKBH5在体外和体内促进细胞增殖、迁移和侵袭。

ALKBH5通过m6A-YTHDC1依赖性方式降低FOXO1 mRNA水平。

ALKBH5通过FOXO1/β-catenin信号通路促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。

研究方法

样本与数据分析：研究者收集了55例神经胶质瘤患者的肿瘤组织样本，并利用TCGA和CGGA数据库分析ALKBH5表达水平与肿瘤分级的关系。

细胞实验：使用多种神经胶质瘤细胞系（U87-MG、U251等），通过shRNA敲低和过表达ALKBH5，检测其对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。实验包括CCK-8实验、EdU实验、克隆形成实验、Transwell实验和3D球体侵袭实验。

动物实验：构建裸鼠原位肿瘤移植模型，通过生物发光成像技术监测肿瘤生长，并评估ALKBH5敲低或过表达对肿瘤生长和小鼠生存率的影响。

分子机制研究：利用m6A-MeRIP-seq、RNA-seq、RNA pulldown和免疫共沉淀等技术，鉴定ALKBH5的靶基因，并研究其通过m6A修饰调控FOXO1表达的机制。

研究结果

（1）ALKBH5在神经胶质瘤中的表达与预后

ALKBH5在神经胶质瘤中的表达显著高于正常组织，且与肿瘤分级呈正相关。高表达ALKBH5的患者预后更差，生存期更短。

图1：神经胶质瘤中ALKBH5表征。

（2）ALKBH5在体外和体内促进细胞增殖、迁移和侵袭。

在体外实验中，ALKBH5敲低显著抑制了神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而ALKBH5过表达则促进了这些能力。在裸鼠原位肿瘤模型中，ALKBH5敲低缩小了肿瘤体积，延长了小鼠生存期，而ALKBH5过表达则加速了肿瘤生长，缩短了生存期。

图2：ALKBH5在体外促进细胞增殖、迁移和侵袭。

图3：ALKBH5在体内促进神经胶质瘤的致瘤性。

（3）ALKBH5通过m6A修饰调控FOXO1表达

通过m6A-MeRIP-seq和对应的RNA-seq分析，研究者发现ALKBH5可能通过m6A修饰调控FOXO1表达。ALKBH5敲低导致FOXO1 mRNA的m6A修饰增加，FOXO1 mRNA稳定性提高，进而上调FOXO1蛋白表达。YTHDC1被鉴定为FOXO1 mRNA的m6A"reader"蛋白，其结合增加了FOXO1 mRNA的稳定性。

图4：MeRIP-seq和RNA-seq鉴定FOXO1为ALKBH5介导的m6A修饰的下游靶点。

(A) 与对照细胞相比，ALKBH5敲低的U251细胞中m6A富集peaks。

(B) 与对照细胞相比，ALKBH5敲低的U251细胞中差异表达基因。

(C-D) U251细胞中m6A位点的最富集motif（C）和分布情况（D）。

(E) 与对照细胞相比，ALKBH5敲低的U251细胞中差异表达基因的通路富集分析。

(F) 与对照细胞相比，ALKBH5敲低的U251细胞中FOXO1靶基因的基因集富集分析。

(G) MeRIP-seq和RNA-seq中差异表达基因的相对变化倍数。

(H-J) qRT-qPCR（H）和Western blot（I-J）检测结果显示ALKBH5敲低后FOXO1表达增加。

(K) 通过m6A-qPCR检测到ALKBH5敲低后FOXO1转录本的m6A修饰水平增加。

(L) RIP-qPCR显示ALKBH5与FOXO1转录本的结合。

图5：ALKBH5通过m6A-YTHDC1依赖性方式调控FOXO1 mRNA稳定性。

(A-B) qRT-qPCR检测U87（A）和U251（B）细胞中FOXO1的表达和分布。

(C-D) U87和U251细胞ALKBH5敲低后用放线菌素D处理，FOXO1 mRNA随时间的降解率测定和qPCR分析。

(E) 通过RNA pulldown实验和质谱分析鉴定的三种候选m6A"reader"蛋白。

(F) 在U87和U251细胞中，使用细胞裂解物、完整的生物素标记FOXO1、FOXO1 CDS、3'-UTR和5'-UTR（有或无m6A motif突变）或NC进行RNA pulldown实验后，对YTHDC1、HNRNPA2B1和HNRNPC进行Western blot检测。

(G) 在CGGA队列的胶质瘤患者中，FOXO1和YTHDC1表达的相关性分析。

(H-I) RIP-qPCR显示YTHDC1与U87（H）和U251（I）细胞中FOXO1转录本的结合。

(J) 在U87和U251细胞中，YTHDC1敲低后FOXO1的Western blot检测。

(K-L) 通过RT-qPCR检测U87（K）和U251（L）细胞YTHDC1敲低后FOXO1的表达和分布。

(M-N) U87和U251细胞YTHDC1敲低后用放线菌素D处理，FOXO1 mRNA随时间的降解率测定和qPCR分析。

（4）ALKBH5通过FOXO1/β-catenin通路促进肿瘤进展

FOXO1与β-catenin互作，抑制β-catenin核积累，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。ALKBH5通过降低FOXO1表达，促进β-catenin核积累，激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。

图6：ALKBH5抑制FOXO1表达，降低体外和体内总生存期（OS）。

图7：ALKBH5抑制FOXO1/β-catenin信号通路。

图8：ALKBH5促进β-catenin表达，降低体外和体内总生存期（OS）。

易小结

本研究通过系统的实验设计和多维度分析，揭示了ALKBH5在神经胶质瘤中的作用机制，特别是其通过m6A修饰调控FOXO1表达的分子通路。这些发现不仅为神经胶质瘤的病理机制提供了新的见解，也为未来的治疗策略提供了潜在的靶点。

MeRIP-seq在本研究中发挥了重要作用

研究者通过MeRIP-seq分析了ALKBH5敲低的U251细胞中m6A修饰的变化。结果表明ALKBH5在正常情况下可能通过去甲基化作用维持这些基因的低m6A修饰水平。

MeRIP-seq还揭示了FOXO1 mRNA的m6A修饰水平在ALKBH5敲低后显著增加。表明FOXO1是ALKBH5调控的m6A修饰的直接靶基因。进一步实验（m6A-qPCR和RIP-qPCR）也证实了ALKBH5与FOXO1 mRNA的结合，并通过去甲基化调控其稳定性。

此外，MeRIP-seq还揭示了m6A修饰在mRNA上的分布模式。ALKBH5敲低后，m6A修饰分布发生了显著变化，这为理解ALKBH5在转录后调控中的作用提供了重要线索。

参考文献：

Wang C, Xu N, Zhong X, Liu B, Tang W, He Z, Zeng H, Guo H. ALKBH5 facilitates tumor progression via an m6A-YTHDC1-dependent mechanism in glioma. Cancer Lett. 2025 Jan 4:217439. pii: S0304-3835(25)00003-5. doi: 10.1016/j.canlet.2025.217439.