WGBS揭示蛋氨酸在母胎免疫耐受和子宫内膜容受中的调控机制

母胎免疫耐受是指母体免疫系统对胎儿抗原的耐受，避免对胎儿产生免疫排斥反应。子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚胎着床的能力。子宫内膜容受性和母胎免疫耐受是成功妊娠的两个关键过程。然而，营养所涉及的分子机制尚未被充分研究。蛋氨酸（methionine）是一种必需氨基酸，在甲基化、抗氧化、多胺合成和免疫调节中发挥重要作用。已有研究表明，蛋氨酸代谢紊乱可能导致胚胎发育障碍和生殖性能下降。IL-5（interleukin-5）是一种细胞因子，主要由Th2细胞分泌，与免疫反应和胚胎发育密切相关。研究假设：蛋氨酸是否可能通过调节胚胎IL-5分泌，影响母胎免疫耐受和子宫内膜容受性？

近日，中国农业大学动物科技学院曾祥芳教授团队通过动物模型验证、分子机制探索以及验证实验揭示蛋氨酸通过调控胚胎IL-5分泌，激活NF-κB通路并促进Th2细胞分化，从而增强母胎免疫耐受和子宫内膜容受性。蛋氨酸通过降低转录因子Eomes的DNA甲基化水平，解除Eomes对IL-5启动子的抑制，最终促进IL-5表达。相关研究成果以《Methionine regulates maternal-fetal immune tolerance and endometrial receptivity by enhancing embryonic IL-5 secretion》发表于《Cell Reports》期刊。

标题：Methionine regulates maternal-fetal immune tolerance and endometrial receptivity by enhancing embryonic IL-5 secretion（蛋氨酸通过增强胚胎 IL-5 分泌来调节母胎免疫耐受和子宫内膜容受性）

发表期刊：Cell Reports

影响因子：IF 7.5 / 1区

技术平台：WGBS、RNA-seq、ChIP-seq

本研究发现母体蛋氨酸供应显著改善了妊娠结局，这与IL-5浓度密切相关。从机制上讲，蛋氨酸诱导胚胎分泌IL-5，从而增强了子宫内CD4+ T细胞向IL-5+ Th2细胞转化，进而改善母胎免疫耐受。与此同时，蛋氨酸介导的IL-5分泌激活了核因子κB（NF-κB）信号通路，并增强子宫内膜细胞中整合素αvβ3表达，从而提高子宫内膜容受性。此外，蛋氨酸还显著影响了转录因子Eomesodermin（Eomes）的DNA甲基化和转录水平。Eomes可以直接与IL-5启动子区域结合，抑制IL-5转录。蛋氨酸通过其对Eomes的作用调控IL-5的转录、母胎免疫耐受和子宫内膜容受性。本研究揭示了蛋氨酸和IL-5的关键功能，并为成功妊娠提供了一种潜在的营养策略。

图形摘要

研究方法

（1）动物模型验证：通过大鼠和猪的饮食干预实验，观察蛋氨酸对妊娠结局的影响，如胚胎着床数、胚胎发育指标等。

（2）分子机制探索：

通过IL-5敲除实验、中和抗体处理，验证IL-5在胚胎黏附和免疫调节的关键作用。

检测NF-κB活化及其下游分子（如整合素αvβ3）的表达，确认信号通路的作用。

通过WGBS、ChIP-seq、RNA-seq等技术，分析蛋氨酸对Eomes基因DNA甲基化、对IL-5转录调控、基因表达的作用。

（3）验证实验：使用基因敲除小鼠（Eomes+/-）和体外细胞实验，进一步确认蛋氨酸-Eomes-IL-5轴的作用机制。

技术方法亮点

（1）多组学整合：结合DNA甲基化、组蛋白修饰（H3K4me3）、转录组（RNA-seq）数据，解析蛋氨酸的表观遗传调控网络。

（2）跨物种验证：大鼠、猪、人细胞模型的多物种数据支持结论的普适性。

（3）动态分析：从胚胎着床（妊娠第5天）到胎盘发育（妊娠第12-18天）的时序性研究。

结果图形

（1）蛋氨酸对妊娠结局的影响：蛋氨酸可改善胚胎发育和妊娠结局

研究发现，母体蛋氨酸供应显著改善了妊娠结局，表现为增加胚胎着床数量和提高胚胎发育质量。蛋氨酸对SAM/SAH比率（甲基化效率的重要指标）的影响强于其他一碳营养素。

图1：蛋氨酸改善胚胎发育和妊娠结局

(A) 实验设置示意图。从妊娠第1天到第7天，怀孕大鼠被喂食22种不同水平的叶酸、甜菜碱、胆碱和蛋氨酸饲料。

(B) 响应面图显示着床位点数量与饮食中一碳营养素含量之间的关系。

(C) 响应面图显示胚胎着床均匀性与饮食中一碳营养素含量之间的关系。

(D) 响应面图显示血清中SAM/SAH比率与饮食中一碳营养素含量之间的关系。

(E) 不同蛋氨酸浓度处理的合子的囊胚率。

(F) 在早期妊娠期间喂食蛋氨酸补充饮食的大鼠的着床位点数量。

(G) 实验设置示意图。怀孕大鼠在早期妊娠期间或整个妊娠期间被喂食缺乏蛋氨酸的饮食。所有雌性后代都被跟踪观察，喂食含有足够蛋氨酸的标准饮食，并观察其妊娠表现。

(H-J) 在早期妊娠期间或整个妊娠期间蛋氨酸缺乏大鼠的生殖表现。

(K-M) 大鼠后代的生殖表现。

(N-P) 大鼠第二轮妊娠的生殖表现。

（2）IL-5的关键作用：蛋氨酸增强胚胎 IL-5 分泌和母胎界面的免疫稳态

蛋氨酸诱导胚胎分泌IL-5，进而增强CD4+ T细胞向IL-5+ Th2细胞的转化，改善母胎免疫耐受。同时，IL-5通过激活NF-κB信号通路，增加整合素αvβ3的表达，从而提高子宫内膜容受性。

图2：蛋氨酸增强胚胎IL-5分泌及母胎界面的免疫稳态

(A) 血清细胞因子、蛋氨酸代谢物与母猪生殖表现的相关性散点图。

(B) 猪胚胎中IL-5的表达情况。

(C-E) 在妊娠第5天，喂食蛋氨酸的大鼠血清中蛋氨酸、SAM和IL-5的浓度。

(F-H) 在妊娠第5天，喂食蛋氨酸的大鼠子宫液中蛋氨酸、SAM和IL-5的浓度。

(I-J) 不同蛋氨酸饮食喂养的大鼠囊胚中IL-5（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色及强度。n = 12。

(K) 喂食不同水平蛋氨酸的怀孕大鼠母胎界面处Th1和Th2细胞的数量。

(L-N) 从小鼠子宫组织分离的CD4+ T细胞中，CD4+ Th1细胞和CD4+ IL-5+细胞的数量。这些细胞经过蛋氨酸、重组小鼠IL-5处理，或用蛋氨酸预处理的滋养层细胞培养上清液处理，或与蛋氨酸和中和性抗IL-5单克隆抗体（mAbs）的组合处理。

（3）蛋氨酸通过 IL-5 调控子宫 NF-κB 通路和母胎免疫耐受性

图3：蛋氨酸通过IL-5调控子宫NF-κB通路和母胎免疫耐受

(A) 经蛋氨酸处理和IL-5敲除的人类滋养层细胞的粘附率。

(B-C) IL-5敲除的人类滋养层细胞经蛋氨酸处理24h后，收集上清液并用于处理人类子宫内膜细胞24小时。图中显示了人类子宫内膜细胞中LIF、HOXA1、整合素αvβ3、p65 NF-κB和p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的Western blot分析。

(D) 经蛋氨酸处理的人类滋养层细胞与经IL-5RA敲除或NF-κB抑制剂处理的子宫内膜细胞粘附率。

(E-F) 在体外植入模拟实验中，经蛋氨酸处理的人类滋养层细胞和经IL-5RA敲除及NF-κB抑制剂处理的子宫内膜细胞的Western blot分析，检测IL-5RA、LIF、HOXA1、整合素αvβ3和p65 NF-κB的表达。

(G) 实验设置示意图。收集合子并微注入对照H₂O、IL-5和中和性抗IL-5单克隆抗体（mAb），然后将其移植到假妊娠的IL-5基因敲除（Il-5-/-）或野生型（WT）小鼠中。

(H) 注射IL-5和中和性抗IL-5单克隆抗体（mAb）的合子所移植小鼠的着床位点数量。

(I) 向子宫角内注射生理盐水、IL-5或中和性抗IL-5单克隆抗体的大鼠的着床位点数量。

(J-K) 向子宫角内注射生理盐水、IL-5或中和性抗IL-5单克隆抗体的大鼠着床位点组织中IL-5、p65 NF-κB和整合素αvβ3的Western blot分析。

(L) 向子宫角内注射生理盐水、IL-5或中和性抗IL-5单克隆抗体的大鼠母胎界面处Th1和Th2细胞的数量。

(M) 饲喂不同水平蛋氨酸饮食并腹腔注射IL-5、中和性抗IL-5单克隆抗体和PBS的免疫性自发流产小鼠的着床位点数量。

(N-O) 饲喂不同水平蛋氨酸饮食并腹腔注射IL-5、中和性抗IL-5单克隆抗体和PBS的免疫性自发流产小鼠着床位点组织中IL-5、IL-5RA、p65 NF-κB和整合素αvβ3的Western blot分析。NP：同系妊娠（syngeneic pregnant）；AP：异系妊娠（allogeneic pregnant）。

（4）蛋氨酸通过调控转录因子 Eomes 甲基化来增强 IL-5 转录

研究发现，蛋氨酸通过影响Eomes基因的DNA甲基化水平来调节IL-5的表达。Eomes可以直接结合到IL-5启动子区域，抑制其转录。蛋氨酸的补充可以阻止Eomes与IL-5启动子结合，从而促进IL-5表达。

图4：蛋氨酸通过调控转录因子Eomes的甲基化增强IL-5转录

(A) 细胞分离示意图。

(B) 猪滋养层细胞中蛋氨酸的碳-13和氢-3对不同大分子分数的相对贡献。

(C) 大鼠囊胚中差异表达的转录因子热图。

(D) 不同蛋氨酸饮食喂养的大鼠囊胚中CDX2、NANOG、SOX17、EOMES和DAPI的免疫荧光染色。

(E) 大鼠囊胚中Eomes的DNA甲基化水平。

(F) 经蛋氨酸处理的人类滋养层细胞中Eomes和IL-5的Western blot分析。

(G) 在妊娠期间喂食不同浓度蛋氨酸的Eomes+/-小鼠着床位点组织中p65 NF-κB、整合素αvβ3和IL-5的Western blot分析。

(H) 喂食蛋氨酸的WT和Eomes +/-小鼠血清中IL-5的浓度。

(I) 喂食蛋氨酸的WT和Eomes +/- 小鼠母胎界面处Th2细胞的数量。

(J) 经蛋氨酸和DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理的人类滋养层细胞中IL-5的浓度。

(K) 经蛋氨酸和DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理的人类滋养层细胞的粘附率。

(L) 共转染Eomes和IL-5启动子的人类滋养层细胞中相对荧光素酶活性。

(M) IL-5启动子上的四个假定的富含GC的区域（IL-5 1、2、3和4）。

(N) 人类滋养层细胞中EOMES结合IL-5启动子的富集情况。

(O) 共转染Eomes和IL-5启动子的人类滋养层细胞中相对荧光素酶活性。

图S4：蛋氨酸通过调节转录因子Eomes甲基化增强IL-5转录

(A) 不同蛋氨酸饮食喂养的大鼠囊胚中5mC、5hmC、H3K4me3、H3K27me3、H3K9me3和DAPI的免疫荧光染色。

(B) WGBS揭示功能区域中差异甲基化区域的DNA甲基化比例。

(C) ChIP-seq揭示功能区域中差异甲基化区域的H3K4me3比例。

(D) RNA-seq揭示甲基转移酶和去甲基化酶平均表达水平的热图。

(E) 联合分析揭示全基因组DNA甲基化水平与基因表达的相关性。

(F) 经不同水平蛋氨酸处理或H3K4和DNA甲基化抑制剂处理的大鼠囊胚的免疫荧光染色。

(G) 囊胚中差异表达基因和启动子甲基化的聚类分析。

（5）蛋氨酸调控胎盘中 EOMES 和 IL-5 的表达

图5：蛋氨酸调节胎盘中EOMES和IL-5的表达

(A-F) 在妊娠第12天、第14天和第18天，不同蛋氨酸饮食下大鼠血清中蛋氨酸代谢物SAM和SAH的浓度。

(G-H) 在妊娠期间喂食不同浓度蛋氨酸的大鼠胎盘中，IL-5RA、IL-5、EOMES、HOXA1、LIF、p65 NF-κB和整合素αvβ3的Western blot分析。n = 12。

易小结

本研究通过多模型、多组学的系统性分析，揭示了蛋氨酸通过表观遗传调控Eomes-IL-5轴改善妊娠结局的分子机制，为营养干预妊娠并发症提供了理论依据。未来需进一步推动临床转化，并深化对一碳代谢网络与免疫微环境交互作用的理解。

通过全基因组DNA甲基化测序的WGBS技术，研究者系统评估了蛋氨酸对胚胎全基因组DNA甲基化模式的影响。研究发现，蛋氨酸补充显著降低了胚胎中Eomes基因启动子区的DNA甲基化水平，从而解除其对IL-5的转录抑制。

通过H3K4me3的ChIP-seq，研究者发现蛋氨酸补充显著增加了胚胎中H3K4me3的富集程度（尤其在基因启动子区），表明蛋氨酸通过促进组蛋白激活标记增强基因转录活性。

RNA-seq鉴定了蛋氨酸处理下胚胎中371个差异表达基因，包括H3K4甲基转移酶（Kmt2家族）的上调和DNA甲基转移酶（Dnmt3a等）的下调，与WGBS和ChIP-seq发现的表观遗传变化一致。

通过整合WGBS（DNA甲基化）、ChIP-seq（H3K4me3修饰）和RNA-seq（基因表达）数据，构建了蛋氨酸调控IL-5的表观遗传网络，联合分析揭示Eomes为蛋氨酸-IL-5轴的核心调控因子，并通过双荧光素酶报告实验和ChIP-qPCR验证其直接结合IL-5启动子。时序性分析（胚胎到胎盘）显示，蛋氨酸对Eomes的调控持续影响胎盘发育，揭示了表观遗传记忆在妊娠中的长期效应。

总之，本研究利用WGBS、ChIP-seq和RNA-seq及其联合分析为研究蛋氨酸对胚胎发育和母胎免疫耐受的调控机制提供了全面的视角。这些技术不仅揭示了蛋氨酸对DNA甲基化和组蛋白修饰的影响，还通过分析基因表达的变化，揭示了蛋氨酸如何通过表观遗传调控机制影响胚胎发育和免疫耐受。这些发现为理解营养素在生殖健康中的作用提供重要分子基础。

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