高通量筛选抗原特异性的T细胞新工具：即用型HLA-I纳米颗粒

MHC-I蛋白向CD8+ T细胞呈递表位肽，以引发多方面的适应性免疫反应。肽-MHC分子与TCR之间的affinity和avidity是决定激活或无能T细胞状态的基本参数。在此，宾夕法尼亚大学介绍了一种可装载的系统，VLP-Open HLA，其特点是具有可以容纳多达60个可装载HLA分子的病毒样颗粒（VLP）。预先装载有占位配体的HLA纳米颗粒在与目标肽孵育时能够高效地进行肽交换。证明了荧光标记的VLP-Open HLA颗粒可用于染色抗原特异性CD8+ T细胞，提供一种筛选TCR的新型工具。最后，展示了该系统可以以抗原特异性的方式诱导T细胞的活化。可以调整为包含多种HLA等位基因和共刺激分子作为镶嵌纳米颗粒，以实现实验免疫学中的各种应用。

MHC-I分子在适应性免疫中起着核心作用。MHC-I蛋白由一个多态性的重链（HC）、一个不变的轻链β2m和一个8-15个氨基酸长度的表位肽组成，这使得能够对细胞内蛋白质组进行免疫监视。MHC-I分子在内质网中组装，并装载多达10^5个具有免疫原性的肽段，随后运输到细胞表面。在人类群体中，高度多态性的HLA（人类中的MHC，包含超过30000种同种异型）呈现不同的内源性肽库，从而确保物种对新兴胞内病原体的适应性。抗原呈递细胞与CD8+ T细胞之间的特异性结合是由肽加载的MHC分子（pMHC）与T细胞表面表达的克隆型αβ TCR之间中等亲和力(affinity)（微摩尔范围KD）的相互作用赋予的。强烈的T细胞激活和增殖以维持免疫反应依赖于共刺激受体、黏附分子的参与，并需要足够的TCR:pMHC相互作用来排除CD45磷酸酶并最终通过不同机制触发TCR-CD3复合物。因此，由于TCR:pMHC相互作用的半衰期较短，可溶性单体pMHC-I分子不足以检测或有效激活其抗原特异性T细胞，免疫学界一直依赖于MHC-I多聚体来识别多克隆库中的交叉反应性T细胞，并在各种情况下监测反应。尽管已经开发出几种方法来生成包含数百种不同表位肽的MHC-I分子库，但多聚化的MHC-I分子无法充分刺激T细胞反应，因此仅限于用作探针试剂。因此，迫切需要能够快速准确筛选出能够引发特定T细胞反应的表位肽的系统，以用于免疫学研究和治疗开发。

为了解决这一挑战，研究人员开发了纳米级人工抗原呈递细胞（aAPCs），用于富集和扩增抗原特异性T细胞，其中包括铁-右旋糖酐顺磁性纳米颗粒（50-100nm）、生物素涂层的量子点纳米晶体（30nm）以及较大尺寸的aAPCs（300nm），还有基于磁性纳米颗粒的抗原特异性T细胞检测方法。aAPCs能够激活并快速扩增黑色素瘤患者的抗原特异性T细胞。基于pMHC的aAPCs可以扩增针对癌症和自身免疫表位特异性的T细胞。其他用于T细胞活化的多聚化方法包括使用anti-CD3和anti-CD28抗体Fab片段功能化的Strep-Tactin（streptavidin的突变体）（Expamers）。最后，CombiCells作为一种合成生物学系统，能够组合展示细胞表面配体，从而研究T细胞抗原敏感性以及共刺激或共抑制受体的调节作用。最近，蛋白质纳米颗粒和基于笼状结构的蛋白质组装体在疫苗设计中引起了广泛关注。病毒样颗粒（VLPs）可以提供多价性和对称性，这些特性已被证明有利于疫苗开发中的抗原呈递。基于研究人员开发的由60个亚基组成的基于KDPG的纳米笼，利用SpyCatcher/SpyTag化学技术开发了展示SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域的VLPs。同一研究团队还建立了SpyCatcher003支架，实现了高效的VLP偶联和增强的稳定性。为了功能化纳米颗粒，SpyCatcher/SpyTag化学技术通过特定位置的偶联，在SpyCatcher蛋白上的赖氨酸残基与SpyTag中的天冬氨酸之间形成不可逆的异肽键。

在这里，开发一种通用的、可装载的基于VLP的纳米粒子平台，用于筛选肽/MHC-I 限制的T细胞反应。已提出多种方法来生成可装载的pMHC分子，包括光解条件配体的UV照射、二硫键直接稳定MHC-I肽结合槽或高温处理。之前建立了一种高通量方法，通过伴侣蛋白介导的交换将占位肽替换为高亲和力肽。最近，采用结构导向的方法开发了构象稳定的、Open或即装即用的MHC-I分子。在此基础上，利用Open MHC-I系统、VLP的增强亲和力以及SpyCatcher/SpyTag介导的多聚化，开发了一种可装载的Open MHC纳米粒子平台，该平台兼容不同的HLA异构体（VLP-Open HLA）。与Open MHC分子偶联的纳米粒子能够在体外高效进行肽交换，形成稳定的pHLA显示平台。作为概念验证，证明了该VLP-Open HLA（Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1）可以荧光标记以染色抗原特异性NY-ESO-1 TCR（1G4）CD8+ T细胞，并且可以在体外以可检测的方式特异性激活T细胞。平台提供了一个基于蛋白质的极简系统，可用于系统地筛选和评估针对广泛p/HLA组合的T细胞反应。

设计和表征VLP-Open HLA偶联物

为了生成VLP-Open HLA纳米颗粒，将SpyTag标记的Open MHC展示在VLP-SpyCatcher-mi3上。首先，通过一个富含Gly的接头将Open HLA-A*02:01的重链胞外域与SpyTag003融合（蛋白序列见表S2）。设计的Open HLA-A*02:01具有重链（G120C）和轻链β2m（H31C）之间的链间二硫键（图1A和B）。与天然分子相比，这种工程化的Open MHC I表现出更高的稳定性，并且可以通过稳定肽受体构象快速加载外源肽。这提供了一个即用型的MHC I系统，适用于探测T细胞活性和低亲和力配体筛选。使用高亲和力肽NY-ESO-1-C9V（SLLMWITQV）、突变的诱饵肽NY-ESO-1-W5A（SLLMAITQV）以及中等亲和力的占位肽gTAX（LFGYPVYV）对SpyTag标记的Open HLA-A*02:01进行了复性（图1C）。发现添加SpyTag并不会损害蛋白质的热稳定性，这一点从使用差示扫描荧光法（DSF）测得的不同肽复性的SpyTag标记的Open HLA-A*02:01的高Tm值（51.8ºC-58.9ºC）可以明显看出。

表S2 蛋白序列

图1 设计、生产和生物物理表征的VLP-Open HLA系统。

选择了基于蛋白质的纳米颗粒平台VLP，因其多功能性、易于组装、稳定性以及理想的抗原展示几何结构。具体而言，专注于SpyCatcher-mi3支架（VLP上有60个结合位点），这使得VLP偶联更加高效并增强了稳定性，并且可以在大肠杆菌中表达。对于偶联反应，优化了SpyCatcher-mi3和SpyTag Open HLA-A*02:01的摩尔比（表S3）。结果显示，比例为1:180时，最终浓度例如50nM SpyCatcher-mi3颗粒和9μM SpyTag Open HLA可以达到最佳的偶联效率。然后将SpyTag Open HLA-A*02:01与NY-ESO-1-C9V、NY-ESO-1-W5A或gTAX肽进行复性；SDS-PAGE凝胶上的条带移动确认了通过共价键实现的偶联（图1D）。在表征和后续实验之前，使用高分子量截留（100kDa MWCO）离心柱去除了任何聚集体和未偶联的Open HLA分子。

表S3 等效（VLP:HLA摩尔比）和浓度用于偶联反应。每个SpyCatcher-VLP颗粒最多可容纳60个偶联位点

通过SpyCatcher-SpyTag化学反应实现的强效偶联反应，导致了VLP-Open HLA蛋白纳米颗粒的形成，并通过动态光散射（DLS）进一步证实。仅有的VLP颗粒大小（RH = 16.02±0.12 nm）与文献报道一致（RH = 18.6±4.8 nm）（图1E）。与Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-C9V或Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-W5A偶联后颗粒尺寸的增加，与HLA分子（~47kDa和411aa）偶联后的尺寸增加一致。进一步使用质量光度法对颗粒进行了表征，观察到的质量与预期的未偶联和偶联颗粒的质量值相符（图1F）。VLP-Open A*02:01/NY-ESO-1-C9V显示偶联颗粒的质量分布为4126±402 kDa，表明pHLA分子在VLP上的平均占据位点约为60个中的46个（图1F）。冷冻电子显微镜进一步证实了笼状结构的存在（图1G）。这些研究共同支持了通过大肠杆菌中重组蛋白表达体外组装，VLP纳米颗粒能够稳健地展示Open的MHC I分子。

VLP-Open HLA分子可以在体外捕获外源性肽段

之前已经确定，设计的Open MHC-I结构能够增强多态性HLA分子中的占位肽交换。接下来，考察了与VLPs偶联的Open HLA（Open HLA-A*02:01）是否保留其增强的肽交换特性，以评估其作为免疫原性肽筛选系统的潜力。在与VLP支架偶联之前，Open HLA-A*02:01与占位肽gTAX进行了重构。通过荧光偏振（FP）观察到在VLP-Open HLA上，gTAX与标记肽TAMRA-TAX9（TAMRA-KLFGYPVYV）之间迅速发生了肽交换（图2A和B）。荧光标记肽的结合在独立重复的VLP样品制备中保持一致。肽装载依赖于纳米颗粒浓度，显示出与先前使用可溶性MHC I分子研究中观察到的整体相似的轮廓。在室温下4h内观察到了完全的肽交换，而野生型HLA-A*02:01则几乎没有发生交换。因此，VLP-Open HLA-A*02:01/gTAX设计可以在体外促进高效的肽交换。

此外，进行了质谱实验，证明平台可以用于从生物样本中鉴定潜在的免疫原性肽段。作为概念验证，VLP-Open HLA-A*02:01/gTAX 被替换为单个肽段或一组来自TCGA的50个候选高亲和力肽段，这些肽段之前已被该团队验证过。使用离心柱洗涤过量的肽段以保留结合的肽段；包括仅含肽段（不含VLP-Open HLA粒子）的阴性对照和含有无关肽段的VLP-Open HLA粒子的阴性对照，以确保方法能够有效洗脱过量的肽段。通过液相色谱-质谱（LC-MS）鉴定了捕获的肽段。如预期的那样，发现预测的高亲和力肽段保留在VLP-Open HLA 纳米颗粒上，并在这里的数据中被轻易识别（图2C）。还展示了VLP-Open HLA-A*02:01/gTAX 与TCGA表位库中的单个或混合肽段孵育的额外质谱数据，使用了两种互补的方法--LC-MS和MALDI-MS。

图2 VLP-Open HLA可以捕获和显示外源性肽。

荧光标记的Open HLA-VLPs可以检测抗原特异性T细胞

VLP-SpyCatcher-mi3可以在与过量的Open HLA分子偶联之前，通过与NHS-fluorescein反应进行荧光标记，而不影响其pHLA偶联能力（图3A）。从SDS-PAGE分析结果来看，在 UV辐照和Coomassie染色之前，可以观察到标记后的样品显示出一条与SpyCatcher-mi3对应的绿色条带（VLP在还原条件下的SDS-PAGE凝胶中显示为单体）（图3B）。MALDI-MS质谱数据确认VLP单体已有效与fluorescein偶联，表现为对应于3-5个赖氨酸残基标记的质量偏移。

标记的SpyCatcher-VLP成功地与Open HLA-A*02:01结合，使用已建立的结合协议后者分别与NY-ESO-1-C9V或NY-ESO-1-W5A重构（图3B）。随后，使用表达针对癌睾抗原NY-ESO-1特异的1G4 TCR的原代人T细胞，探讨了荧光标记的VLP-Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-C9V是否可以用于检测抗原特异性CD8+ T细胞（图3C）。使用四聚体化的Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-C9V分子确认了工程化1G4 T细胞的抗原特异性染色（阳性对照），而含有NY-ESO-1-C9V关键氨基酸替换以实现与1G4 TCR高亲和力相互作用的Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-W5A Tetramer显示了低背景染色水平（阴性对照）（图3C左）。发现VLP-Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-C9V显示出明显的中位荧光强度（MFI）偏移，从而能够有效染色和检测NY-ESO-1 TCR（1G4）CD8+ T细胞（图3C右）。

图3 VLP-Open HLA系统可以检测抗原特异性T细胞

Open HLA-VLP纳米颗粒在体外诱导抗原特异性T细胞活化

为了评估VLP-Open HLA-I平台是否能够引发抗原特异性T细胞的活化和增殖，将Open HLA-A*02:01与NY-ESO-1-C9V重新折叠后连接到VLP上，并在体外刺激CD8+ 1G4 TCR-T细胞（图4A）。发现，即使在非常低的浓度下，VLP-Open HLA-A*02:01也能引发抗原特异性的增殖，这通过CellTrace Violet标记的1G4 TCR-T细胞的极限稀释分析得到验证。在最低测试浓度（0.39 µg/mL；VLP复合物约为4.9 MDa）时，VLP-Open HLA-A*02:01诱导的增殖水平与商业化的Human T-Activator anti-CD3/anti-CD28 Beads相当（图4B，图S17）。在这一浓度下的增殖是抗原特异性的，因为用展示NY-ESO-1-W5A的VLP刺激仅触发了较低水平的增殖。对T细胞活化标志物的定量显示了类似的趋势，抗原特异性诱导4-1BB表达最高可达1.56 µg/mL（图4C，图S17）。与此趋势一致的是，用VLP-Open HLA-A*02:01颗粒激活引发了抗原特异性的IFN-γ产生，如ELISA所测量（图S19）。值得注意的是，在较高浓度的VLP-Open HLA-I中，装载低亲和力NY-ESO-1-W5A肽的HLA-I也能引发CD8+ 1G4 T细胞的活化，这可能归因于VLP-Open HLA-I平台提供的高亲和力。

接下来，测试VLP-Open HLA-A*02:01上装载的占位肽是否可以被感兴趣的抗原交换，因为这将使单一库存的VLP能够用于不同的HLA-A*02:01结合肽。制备了装载有占位gTAX肽的VLP-Open HLA-A*02:01，并将其与最高达0.24 μM的NY-ESO-1-C9V和NY-ESO-1-W5A肽一起孵育（这一浓度理论上会饱和所有60个结合位点；VLP-HLA：肽摩尔比为1:60）。在这些T细胞激活实验中，肽并未在使用前被洗掉。为了控制过量肽可能产生的任何影响，也准备了相同浓度的肽（不含VLP）作为T细胞激活实验中的肽对照（图S18）。用NY-ESO-1-C9V交换后的VLP-Open HLA-A*02:01/gTAX刺激诱导了1G4 T细胞表达4-1BB和CD69并产生IFN-γ，而用NY-ESO-1-W5A交换后的VLP或装载gTAX肽的VLP或单独的肽则没有这种效果（图4D-E，图S18）。因此，VLP-Open HLA-I系统通过简单的孵育即可实现占位肽与目标肽的交换，无需洗涤步骤。

最后，试图评估用于检测VLP刺激后T细胞活化/分化的常见标志物。首先进行了细胞内细胞因子染色，发现VLP-Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-C9V刺激增加了产生IFN-γ和IL-2的1G4 T细胞的频率（图4F-G）。同样地，在VLP-open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-C9V刺激的细胞中，激活/耗竭标志物PD-1上调，但在VLP-Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-W5A或仅用VLP处理的1G4 T细胞中未见上调（图4H）。最后，对T细胞分化标志物T-bet和Eomes进行了染色，发现在用VLP-Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-C9V或anti-CD3/anti-CD28 Beads刺激的细胞中，这些转录因子的表达增加（图4I-J）。T-bet与Eomes表达的比例相似，表明VLP-Open A*02:01/NY-ESO-1-C9V驱动效应T细胞分化的方式类似于anti-CD3/anti-CD28 Beads诱导的方式。综上所述，这些数据表明VLP-Open HLA刺激产生的TCR信号与天然刺激相似，能够引发多种不同标志物的可测量反应。

图4 VLPs在体外诱导CD8+ T细胞的抗原特异性活化

图S17 探索VLP-Open HLA-A*02:01/NY-ESO-1-C9V的最佳工作浓度范围以特异性激活T细胞，并依赖于同源抗原。

图S18 VLP-Open HLA-A*02:01/gTax与NY-ESO-1-C9V 交换后，可以以同源抗原依赖的方式触发T细胞活化。

图S19 ELISA分析显示，使用VLP-Open HLA-A*02:01颗粒进行T细胞活化实验时，从细胞上清中检测到的IFN-γ水平。

总结

在这里，宾夕法尼亚大学描述并开发了VLP-Open HLA，这是一种可装载的系统，具有类似病毒颗粒的蛋白质笼和之前描述的工程化Open HLA蛋白质。利用SpyCatcher/SpyTag化学技术，成功生产并表征了VLP-Open HLA颗粒。证明这些纳米颗粒可以预先装载占位配体，并能高效地与候选肽段交换，显示出其作为筛选生物样本中肽段混合物工具的潜在用途。进一步展示了荧光标记的VLP-Open HLA颗粒可用于染色抗原特异性CD8+ T细胞，提供了一种评估不同研究和临床环境中TCR交叉反应性的工具。VLP-Open HLA具有60个单元的十二面体几何结构，具备亲和性和多价性特征，能够高效促进pMHC分子与TCR之间的相互作用，不仅能够识别，还能以抗原特异性方式激活CD8+ T细胞。

该平台可以适应展示广泛的患者来源的HLA I类和HLA II类等位基因及新抗原，以镶嵌纳米颗粒的形式呈现，从而实现新兴的癌症免疫治疗应用，例如个性化T细胞疫苗和基于T细胞的疗法，同时作为有前景的患者特异性免疫疗法筛选工具。具体而言，除了作为筛选和研究工具外，VLP-Open HLA平台可以被利用来构建一个可加载的、多价系统，展示不同等位型和抗原特异性的MHC I分子，以激发个性化的多克隆抗肿瘤反应。例如，VLP-Open HLA系统可以与在特定患者中表达的重组HLA蛋白结合，加载一组候选新抗原，以激发针对患者肿瘤特异性HLA基因型和新抗原的多克隆T细胞。这将有助于开发个性化T细胞疫苗、自体T细胞疗法如TILs，以及用于患者肿瘤特异性合成免疫受体的筛选工具，例如ScFv抗体、CARs或BiTEs。总体而言，VLP-Open HLA平台的初步设计，为这些有前景的未来应用奠定基础。

此外，VLP-Open HLA-I平台与所有位点结合的Open HLA-I分子表现出的高亲和力为未来开发镶嵌颗粒打开了大门，这些颗粒可以将共刺激分子与抗原负载的HLA-I共同结合，用于许多有前景的体外和体内应用。VLP-Open HLA-I颗粒的大小（约30nm）使其能够在体内广泛分布，因为它们足够小，可以从免疫接种部位直接高效地引流到淋巴器官。因此，预计适当剂量的VLP-Open HLA-I会在体内广泛分布到大多数T细胞群体中。然后可以设想在VLP表面结合正向或负向共刺激分子，以驱动T细胞在癌症治疗中的强效激活、存活和扩增，或引导自身免疫疾病中的无反应性和耗竭。这些应用可能会产生较轻的副作用，因为VLP-Open HLA-I靶向可能使较低剂量即可达到理想的抗原特异性效果。

从肿瘤学和自身免疫的角度来看，VLP-Open HLA-I粒子装载特定肽混合物的能力具有重要意义，因为这可以同时刺激或抑制多个抗原特异性T细胞群，可能增加持续治疗效果的概率。总之，该平台提供了一个多功能、模块化和可装载的系统，用于影响T细胞抗原特异性反应，具有广泛的体外和体内应用。

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