文献解读：文库筛选助单细胞转录组学揭秘T细胞基因表达调控网络

【文献解读】CRISPR文库筛选联合单细胞转录组学助力揭秘T细胞基因表达的动态调控网络

2025年1月，Alex Marson教授团队在《Nature》杂志上发表了一篇题为"Central control of dynamic gene circuits governs T cell rest and activation"的研究论文，该杂志的影响因子高达50.5。研究中，团队结合CRISPR筛选技术和单细胞转录组学，揭示了T细胞在静息和激活状态下基因表达的动态调控网络。通过系统性鉴定调控IL-2Rα表达的转录因子和表观遗传调控因子，研究进一步揭示了MED12在T细胞状态转换中的核心调控作用，为免疫治疗领域带来了新的靶点和策略。

T细胞在免疫系统中发挥着关键作用，其功能多样性依赖于细胞内基因表达网络的精细调控。T细胞的激活与静息状态之间的转换对于维持免疫稳态至关重要。IL-2Rα（CD25）是T细胞激活的一个关键标志，其表达水平在不同T细胞亚群中表现出不同的调控模式。例如，在效应性T细胞（Teff）中，IL-2Rα在激活后会短暂高表达；而在调节性T细胞（Treg）中，IL-2Rα则持续高表达。然而，调控IL-2Rα表达的转录因子和表观遗传调控因子在不同细胞类型和状态下的具体作用尚不清楚。

为了全面理解IL-2Rα的调控机制，研究者们采用了CRISPR筛选技术，结合单细胞转录组学和染色质分析，揭示了T细胞在静息和激活状态下基因表达的动态调控网络。

一、CRISPR筛选流程与结果

1、细胞分离与激活

研究者从健康人类供体的外周血白细胞分离包（Leukopak）中分离出CD4+ T细胞，包括调节性T细胞（Treg）和效应性T细胞（Teff）。这些细胞随后用CD3/CD28/CD2激活剂（ImmunoCult™）刺激，以诱导细胞激活并表达IL-2Rα。激活后的细胞被分为三组：静息Teff细胞、静息Treg细胞和激活的Teff细胞。

2、sgRNA文库准备与转染

研究者使用了一个包含约6000个单导向RNA（sgRNA）的CRISPR文库，靶向T细胞中表达的转录因子和染色质修饰因子（约1350个基因）。这些sgRNA通过病毒载体转染到激活后的T细胞中，使每个细胞随机获得一个sgRNA，从而实现基因敲除。

3、细胞培养与筛选

转染后的细胞在含有IL-2的培养基中培养，以支持细胞的存活和增殖。细胞被分为三组进行筛选：静息Teff细胞：培养10天后，筛选IL-2Rα低表达的细胞；静息Treg细胞：培养10天后，筛选IL-2Rα高表达的细胞；激活Teff细胞：在培养9天后重新刺激细胞，72小时后筛选IL-2Rα高表达的细胞。

4、细胞分选与sgRNA提取

使用流式细胞术（FACS）根据IL-2Rα的表达水平将细胞分为高表达和低表达两组。从分选后的细胞中提取基因组DNA，通过PCR扩增sgRNA序列，并进行测序。通过MAGeCK软件分析测序数据，识别在不同条件下显著影响IL-2Rα表达的基因。

5、筛选结果

静息Teff细胞：筛选出多个负调控IL-2Rα的基因，例如KLF2、SOCS3、MYB等。这些基因在静息Teff细胞中抑制IL-2Rα的表达。

静息Treg细胞：筛选出多个正调控IL-2Rα的基因，例如FOXP3、USP22、MYC等。这些基因在静息Treg细胞中促进IL-2Rα的表达。

激活Teff细胞：筛选出多个正调控IL-2Rα的基因，例如GATA3、BATF、IRF4等。这些基因在激活的Teff细胞中促进IL-2Rα的表达。

MED12的动态调控作用：特别值得注意的是MED12，它在不同细胞类型和状态中表现出动态调控作用。在静息Teff细胞中，MED12是IL-2Rα的负调控因子；而在激活的Teff细胞和Treg细胞中，MED12则是正调控因子。MED12的缺失导致T细胞无法完全进入静息状态或达到激活状态，而是处于一个中间状态。

图1 识别IL-2Rα表达的上下文依赖性调控因子

二、 单细胞转录组学分析

为了进一步验证CRISPR筛选结果并揭示基因调控网络，研究者们在静息和激活状态下的Treg和Teff细胞中进行了单细胞转录组学分析（Perturb-seq）。通过分析每个基因敲除对细胞整体转录组的影响，研究者们构建了T细胞在不同状态下的基因调控网络。

静息Teff细胞：KLF2、SOCS3和MYB等基因被确认为静息Teff细胞中IL-2Rα的负调控因子。敲除这些基因后，IL-2Rα表达显著增加。

激活Teff细胞：GATA3、BATF和IRF4等基因被确认为激活Teff细胞中IL-2Rα的正调控因子。敲除这些基因后，IL-2Rα表达显著降低。

MED12的全局调控作用：MED12的敲除导致静息Teff细胞中IL-2Rα表达增加，而在激活的Teff细胞和Treg细胞中，IL-2Rα表达降低。这表明MED12在T细胞状态转换中起着关键作用。

图2 Perturb-seq（单细胞转录组）揭示了控制T细胞休息和激活的调节网络

三、 MED12的调控机制研究

1、染色质分析

MED12与COMPASS复合体（组蛋白甲基化复合体）相互作用，调控组蛋白H3K4的甲基化。在静息Teff细胞中，MED12的缺失导致H3K4me3水平降低，而在激活的Teff细胞中，MED12的缺失导致H3K4me3水平增加。

2、基因表达网络

MED12通过调控多个关键因子（如KLF2、MYC、ETS1等）来维持T细胞的静息状态或促进激活。在静息Teff细胞中，MED12促进KLF2的表达，从而抑制IL-2Rα；在激活的Teff细胞中，MED12促进MYC和GATA3的表达，从而促进IL-2Rα的表达。

图3 MED12通过塑造染色质来促进细胞类型特异性和刺激特异性的调控

四、MED12对细胞状态的影响

1、细胞状态转换

MED12的缺失导致T细胞无法完全进入静息状态或达到激活状态，而是处于一个中间状态。这表明MED12在T细胞状态转换中起着关键作用。

2、细胞存活和增殖

MED12的缺失限制了激活诱导的细胞死亡（AICD），从而提高了T细胞的存活率和增殖能力。这可能对T细胞的持久性有积极影响。

图4 使图4 MED12的缺失限制了激活诱导的T细胞凋亡

五、 研究意义

通过CRISPR筛选和单细胞转录组学分析，研究者们揭示了T细胞在静息和激活状态下基因表达的动态调控网络。MED12的调控作用为开发新的免疫治疗策略提供了潜在的靶点。例如，通过调节MED12的活性，可以增强T细胞的持久性和功能，从而提高免疫治疗的效果。

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