晚期卵巢癌新辅助化疗前后血液ctDNA值变化与预后有何关联？

本研究旨在评估在CHIVA试验（NCT01583322）纳入的晚期上皮性卵巢癌（EOC）患者中，诊断时（T0）循环肿瘤DNA（ctDNA）检测，以及新辅助化疗（NACT）一个周期后（T1）ctDNA早期下降的预后影响。在T0和每次NACT给药前采集血液样本。通过NGS检测ctDNA。进行多变量分析。p值小于0.05被认为具有统计学意义。比较根据ctDNA动态变化特征划分的不同组别的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。使用Cox生存模型寻找与PFS和OS相关的变量，通过Kaplan-Mayer曲线展示PFS和OS差异。采用对数秩检验比较两条曲线。共纳入188例患者。168例患者在T0时有血液样本，160例患者在T0和T1时均有血液样本，可以评估ctDNA比率的动态变化。在T0时，107例患者（63.7%）检测到ctDNA。在T1时，137例（85.6%）患者的ctDNA呈阴性或下降超过80%。ctDNA比率的早期下降与显著较优的PFS（p = 0.0017）和OS（p = 0.0036）相关。ctDNA比率的有利下降与能够进行肿瘤细胞减灭术（CRS）的可能性更高相关（OR：3.94（95%置信区间1.45-10.70），p = 0.0074）。ctDNA比率的早期下降能够在患者管理早期提供预后信息，有助于为患者提供更准确的信息，为CRS（预康复）做早期准备。

研究背景

上皮性卵巢癌（EOC）是全球女性中第八大常见癌症。一线治疗方案基于铂类化疗联合肿瘤细胞减灭术（CRS），随后使用贝伐珠单抗或聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂进行维持治疗。CRS后无肉眼可见残留病灶是一个重要的预后因素。在疾病确诊后，尽早识别预后标志物对于个性化治疗和确定治疗顺序至关重要。

血浆或血清中可能含有少量的游离DNA（cfDNA），一种双链、高度片段化的DNA，血浆半衰期极短，约为16分钟。其存在是生理现象，但在肿瘤进展过程中其浓度显著增加。实际上，这种cfDNA的一部分至少部分来源于肿瘤。在cfDNA中可以检测到特定的肿瘤基因变化（如突变）或表观遗传变化（如甲基化），这些变化可以界定循环肿瘤DNA（ctDNA）的比例。癌症患者中ctDNA比例的差异很大，占cfDNA的不到0.1%到超过90%不等，并且在包括EOC在内的不同类型癌症患者的血浆中都检测到了ctDNA。

很少有研究探索了ctDNA在EOC中的预后或预测作用。有报道称，CRS前高ctDNA水平是癌症特异性死亡的独立预测因素。由于ctDNA在外周血中易于获取，它不仅在诊断时是一种有吸引力的生物标志物，还可用于监测残留疾病的分子演变或预测复发。它能为指导患者治疗提供有价值的信息，在临床上具有广泛的应用。

本研究旨在评估在前瞻性CHIVA II期试验纳入的晚期EOC患者中，诊断时ctDNA检测和定量，以及NACT一个周期后其早期下降对预后的影响。

研究方法

CHIVA试验是一项随机双盲安慰剂对照II期试验（NCT01583322 ARCAGY-GINECO GROUP GINECO-OV119）。入组的晚期EOC患者在间歇性CRS前接受3-4个周期的治疗，然后进行3-4个周期的辅助治疗，随后使用尼达尼布或安慰剂（随机2:1）进行长达2年的维持治疗。在诊断时和每次NACT给药前采集血液样本。从血浆中提取游离DNA。通过下一代测序（NGS）检测循环肿瘤DNA，使用经过验证的热点panel，涵盖KRAS、EGFR、BRAF、PIK3CA、AKT1、ERBB2、PTEN、NRAS、STK11、MAP2K1、ALK、DDR2、CTNNB1、MET、TP53、SMAD4、FBXW7、FGFR3、NOTCH1、ERBB4、FGFR1和FGFR2基因的500多个热点突变。使用ctDNA致病变异的等位基因分数（VAF）来评估ctDNA的浓度及其在一个周期NACT后的变化。正如在结直肠癌研究中已发表的那样，选择T1（NACT一个周期后）和T0（诊断时）之间ctDNA比率下降80%或更多作为阈值，界定复发风险低或高的人群。

研究结果

在纳入CHIVA研究的188例患者中，168例患者在T0时有用于诊断检测和ctDNA定量的血液样本，160例患者在T0和T1时均有样本，可以评估ctDNA动力学的临床价值。

诊断时ctDNA检测

在T0时，我们确定了两类患者群体，一类是检测到ctDNA的患者（n=107，63.7%），另一类是未检测到ctDNA的患者（n=61，36.3%）。这两类群体的特征见表1。在T0时检测到ctDNA的组中，肿瘤携带BRCA突变的患者更多（18例（16.8%）vs 6例（9.8%），p=0.01）。

表1

通过对数秩检验比较"ctDNA组"和"无ctDNA组"患者的生存状况，结果显示在无进展生存期（PFS）（p=0.7）和总生存期（OS）（p=0.5）方面均无显著差异（图1）。为了确定T0时ctDNA比率的预后价值，我们使用了多变量Cox模型，考虑了其他假定的预后因素（单变量分析中p<0.05）。T0时的ctDNA作为连续变量或二元变量分析。诊断时ctDNA比率作为连续变量，与PFS（风险比（HR）：1.02，置信区间（CI）[1-1.04]，p=0.05）和OS（HR：1.01，CI[0.99-1.04]，单变量分析中p=0.3，未纳入多变量分析）均无关联。当根据T0时是否检测到ctDNA，或根据ctDNA值低于（低）或高于（高）其中位值对患者组进行比较时，诊断时ctDNA与PFS或OS均无关（表2）。在分析中引入BRCA肿瘤状态后，我们观察到不同的OS（对数秩检验，p=0.0062），但在PFS方面无差异（对数秩检验，p=0.2）。BRCA突变肿瘤患者的生存期长于非BRCA突变患者，无论T0时是否存在ctDNA。

图1

表2

新辅助化疗一个周期后ctDNA的早期下降

选择T1和T0之间ctDNA比率下降80%或更多作为界定低或高复发风险人群的阈值（比较T1时未检测到ctDNA的患者群体vs仍检测到ctDNA的患者群体）。使用该标准，我们定义了两组患者。第一组是在T1时ctDNA呈阴性或下降超过80%的患者（"下降组"，n=137，85.6%），第二组是在T1时ctDNA稳定或下降小于80%的患者（"稳定组"，n=23，14.4%）。两组患者的特征及其比较见表3。"稳定组"的患者年龄更大（68（53-79）岁vs 63（31-79）岁，p=0.004），"下降组"中有更高比例的患者适合进行CRS（73.7% vs 47.8%，p=0.02）。

表3

为了确定ctDNA早期下降的预后价值，我们使用了多变量Cox模型，考虑了其他假定的预后因素（单变量分析中p<0.05）。结果显示，其与初始FIGO分期、年龄、分级、组织学或BRCA肿瘤突变状态以及PFS或OS均无关。与更好的PFS相关的因素是接受了CRS和属于"下降组"（HR：1.68，CI[1.03-2.74]，p=0.02）。与更好的OS相关的因素是初始PCI值（即诊断时的腹膜肿瘤负荷）、接受了CRS和属于"下降组"（HR：1.83，CI[1.02-3.26]，p=0.043，表4）。在NACT背景下，虽然"手术"这一变量在诊断时未知，但研究证实无肉眼可见残留病灶的CRS是决定性的预后因素，因此我们可以推测，ctDNA值下降是与更好的PFS和OS相关的预后因素，并且能够在患者管理早期提供预后信息。

表4

通过对数秩检验比较"下降组"和"稳定组"的PFS和OS，结果显示在T1时ctDNA比率早期下降与显著较优的PFS（p=0.0017）和OS（p=0.0036）相关（图2）。

图2

在该队列中，117例有血浆用于ctDNA分析的患者知晓肿瘤BRCA突变状态。其中102例患者属于"下降组"。考虑肿瘤BRCA状态并根据ctDNA值早期下降情况分层的生存曲线表明，预后最佳的患者是ctDNA比率下降且肿瘤携带BRCA突变的患者，其次是ctDNA比率下降但未携带BRCA突变的患者（PFS有统计学显著差异，p=0.00015；OS有统计学显著差异，p=0.0052）。仅有1例肿瘤携带BRCA突变的患者未表现出有利的ctDNA动力学变化。

有利的ctDNA比率下降与能够进行CRS的可能性更高相关（OR：3.94（95%CI 1.45-10.70），p=0.0074）。

讨 论

本研究探索了在晚期EOC患者中，诊断时ctDNA以及NACT一个周期后其早期动态变化的预后影响。我们发现，ctDNA比率的早期下降是与更好的PFS、OS，以及更高的CRS实施可能性相关的预后因素。因此，它能在患者管理早期提供预后信息，有助于为患者提供更精准的信息，为CRS（预康复）做好早期准备。

在EOC及多种肿瘤类型中，ctDNA的早期下降是对系统治疗有反应的生物标志物，尤其在接受免疫检查点抑制剂治疗的患者中（但并非仅限于此类患者），它往往先于影像学缓解或肿瘤缩小。ctDNA比率的早期下降，可能是由于化疗的早期细胞抑制作用，抑制了细胞生长，进而导致ctDNA减少或阴性。一些研究聚焦于EOC诊断时ctDNA检测，在本研究中，诊断时ctDNA状态与PFS或OS无关。然而，Lu等人对八项研究（627名患者）进行的最新荟萃分析表明，ctDNA检测与OS（风险比（HR）=2.36，95%置信区间[1.76, 3.17]）和PFS（HR=2.51，95%置信区间[1.83, 3.45]）均显著相关。本研究的主要结果是，对于晚期EOC患者，T1时ctDNA比率的显著下降与较优的PFS（对数秩检验，p=0.0017）和OS（对数秩检验，p=0.0036）相关。仅有少数研究探索了接受NACT治疗的EOC患者ctDNA下降的预后价值。部分结果与本研究一致，尽管纳入的患者数量较少，提示ctDNA可以作为治疗反应（即化疗敏感性）的预测生物标志物。Parkinson等人报告，NACT一个周期后，检测到的TP53突变的VAF下降超过60%，是PFS的独立影响因素（p=0.008）。Kim等人指出，化疗结束三个月后，ctDNA比率对PFS具有预后价值（p=0.038），且与CA125相比，其影响更为显著。CA125是目前应用最广泛的生物标志物，已知它是EOC的独立预后因素和早期复发的预测指标。此外，基于一线化疗期间CA125动态变化的KELIM CA125评分，也已成为一种预后因素。然而，CA125在许多其他癌症和炎症性疾病中也会升高。一些研究在EOC中对ctDNA和CA125进行了比较，Hou等人发现，与CA125（p=0.113）不同，ctDNA能够预测接受手术和化疗的EOC患者的复发情况（p=0.001）。利用CHIVA研究数据对KELIM CA125进行的研究已发表。ctDNA的半衰期较短，因此与KELIM CA125相比，它能在特定时间提供关于疾病进展的不同信息。在本研究中，ctDNA的优势在于化疗一个周期后就能提供信息，而KELIM CA125代表的是100天内连续三个样本中CA125下降率。由于ctDNA比率取决于肿瘤负荷，其显著下降可能是替代CA125，用于更早识别对化疗敏感、适合进行间歇性CRS患者的指标。我们认为，未来ctDNA研究将为KELIM CA125研究提供补充信息，尤其是在定性方面，并且检测技术将进一步改进，特别是在特异性方面，从而使其更广泛地应用和推广。

ctDNA检测日益受到关注，因为它作为一种理想的非侵入性癌症生物标志物，具有诊断价值，可以识别特定体细胞突变和适合靶向治疗的突变。因此，以非侵入性方式早期鉴定突变，有助于确定初始治疗方案，例如BRCA突变状态，目前这对于PARP抑制剂治疗决策至关重要。在本研究中，肿瘤携带BRCA突变且NACT一个周期后ctDNA显著下降的患者预后最佳（对数秩检验，p=0.00015）。有趣的是，一些研究表明，通过液体活检发现回复突变，有助于解释EOC中规定治疗无效、铂耐药或复发的现象。这些结果都支持，液体活检能够提供定量和定性的综合信息，有助于探讨治疗策略，并且可能是识别预后最佳患者的替代方法。此外，独立于化疗敏感性，ctDNA检测还可用作定性遗传或表观遗传数据的生物标志物。ctDNA的一个预期应用是早期识别复发的发生。该生物标志物的应用领域广泛，不仅限于铂敏感和耐药理念。随着技术的发展，其应用将不断拓展，不过其具体应用场景仍有待明确。

ctDNA比率通常与肿瘤负荷和分期相关。在诊断时，我们观察到ctDNA组中肿瘤携带BRCA1/2突变的患者比例较高。然而，ctDNA比率与BRCA1/2突变之间的关联与ctDNA检出情况无关（至少在技术层面上），因为BRCA1/2突变与TP53突变共存，但在TP53突变组中占比不高。无论诊断时是否检测到ctDNA，肿瘤携带BRCA突变的患者总生存曲线都更好。这一观察结果与BRCA突变患者对化疗更敏感、预后更好的结论一致。

我们使用实验室现有的panel分析样本，检测ctDNA，这意味着我们的生物信息学流程和湿实验工作流程是针对ctDNA的。该流程能够检测0.5% VAF的单核苷酸变异和0.1% VAF的大片段插入或缺失，并且该检测过程已获得法国检验机构（COFRAC 15189）对ctDNA检测的认证。我们使用NGS技术检测并比较了T0和T1时ctDNA的VAF。因此NGS技术在大多数卵巢癌研究中应用，因为涉及广泛的突变，尤其是TP53突变，使得靶向分析较为困难。在高级别浆液性EOC中，TP53是ctDNA识别的准确标志物，因为超过90%的肿瘤存在TP53突变。传统的NGS流程灵敏度阈值在1%左右。在本研究中，通过BPER生物信息学分析的验证，我们能够将NGS技术的灵敏度阈值降低至0.3-0.1%的VAF，从而减少了假阴性结果的数量。然而，对于非TP53突变的肿瘤，所使用的panel在检测ctDNA方面的作用可能有限。在本研究中，有7个样本存在其他基因突变（BRAF、KRAS、SMAD4、PIK3CA、ERBB2、NRAS）。我们的研究目的并非识别BRCA1/2突变。实际上，将BRCA1/2作为ctDNA标志物存在一个问题，即在大多数情况下，BRCA1/2突变并非体细胞事件，因此非肿瘤特异性。对于携带胚系BRCA突变的患者，血浆中始终能检测到该变异，无论ctDNA是否存在。

尽管如此，在EOC中，更大的panel可能包括了BRCA1/2突变或特定的甲基化标志物，以提高检出率。多个研究团队对参与致癌过程的表观遗传修饰进行了研究，揭示了肿瘤类型特异性的特征。甲基化是指在DNA的胞嘧啶核苷酸上添加甲基基团的过程，由DNA甲基转移酶催化。甲基化程度越高，由于核小体的压缩，基因转录就越少。在EOC研究中，最近的一篇综述指出，甲基化谱在检测ctDNA方面比单一标志物分析表现更优。用于检测EOC患者ctDNA的通用肿瘤特异性甲基化标志物仍需进一步验证。然而，在31%的散发性EOC患者中发现了BRCA1基因启动子甲基化，这也可被视为评估EOC中ctDNA的有价值标志物。DNA甲基化模式还有可能在临床确诊最多两年前识别EOC，提示该方法有望作为EOC的筛查工具。

鉴于该技术的靶向性，它需要特定于卵巢癌的甲基化特征信息。虽然甲基化特征在几种癌症（尤其是消化道和肺癌）中已得到验证，但据我们所知，目前在卵巢癌中尚无经过验证的特征。最近，检测方法不断发展，使用基于外显子测序的肿瘤信息，选择一组肿瘤特有的变异，监测ctDNA，提高了检测准确性。这些方法被用作局限性疾病患者的围手术期工具，评估复发风险和后续辅助治疗方案。它们在EOC中的应用仍需进一步评估。

据我们所知，本研究是已知最大的关于NACT后ctDNA值变化的研究（160名患者），患者肿瘤分期相似，从而减少了因肿瘤负荷差异导致的ctDNA浓度差异。血浆量是检测ctDNA的主要限制因素。传统方法的灵敏度阈值通常在0.1-1%之间。当ctDNA含量极低时，突变型与野生型等位基因比率的定量可能较为困难，灵敏度可能不足。尽管如此，本研究中的BPER生物信息学分析使我们能够将NGS技术的灵敏度阈值降低至检测到0.1%的VAF，从而减少了假阴性结果的数量。

ctDNA已被证实是EOC的预后因素，本研究为这一观点提供了更多数据支持。一个重要的挑战是如何更广泛地推广这些技术。我们在临床实践中使用经过验证的小型NGS panel检测ctDNA。由于工作流程已发表并可在R软件包中获取，任何实验室使用该panel都不存在障碍。目前，对于转移性或局部晚期肿瘤患者，ctDNA检测主要用于诊疗。一旦临床价值得到验证，并且为预测预后较差的患者提供替代治疗策略，从诊疗转变为预后检测是可能的。可能需要开展基于ctDNA在不同治疗策略之间进行选择的前瞻性干预性临床试验。

在CHIVA试验的这项辅助分析中，晚期EOC患者在NACT一个周期后ctDNA的早期下降与更好的预后相关。需要进一步研究来提高检测方法的性能，并明确这些技术在患者管理中的价值。这项随机前瞻性II期临床试验的结果支持继续研究开发液体活检作为早期判断患者预后、调整治疗策略的工具。对ctDNA进行定量和定性研究，有望为患者管理提供丰富的早期且有用的信息。所研究的技术和策略需要统一，以更广泛地评估这些方法对临床实践的贡献。

参考文献：

Henri Azaïs, Camille Brochard, Valérie Taly, Louise Benoit, Gwenaël Ferron, Isabelle Ray-Coquard, Benoit You, Sophie Abadie-Lacourtoisie, Coriolan Lebreton, Laurence Venat, Christophe Louvet, Laure Favier, Cyriac Blonz, Nadine Dohollou, Emmanuelle Malaurie, Coraline Dubot, Jean-Emmanuel Kurtz, Eric Pujade-Lauraine, Etienne Rouleau, Alexandra Leary, Anne-Sophie Bats, Hélène Blons, Pierre Laurent-Puig, Prognostic value of circulating tumor DNA at diagnosis and its early decrease after one cycle of neoadjuvant chemotherapy for patients with advanced epithelial ovarian cancer. An ancillary analysis of the CHIVA phase II GINECO trial, Gynecologic Oncology, Volume 192, 2025, Pages 145-154, ISSN 0090-8258, https://doi.org/10.1016/j.ygyno.2024.12.004.

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