Prime Editing实现镰状细胞贫血小鼠模型的体内治愈

Prime Editing（先导编辑）是一种新型的基因编辑技术，它通过结合Cas9蛋白和逆转录酶，能够直接在目标DNA上进行精确的碱基替换、插入或删除，而不依赖于双链DNA断裂。与传统的CRISPR/Cas9技术相比，Prime Editing具有更高的精确性和安全性，能够显著减少了插入缺失（indels）和非目标位点（off-target）编辑的风险。

2023年2月份，《Blood》杂志上发表了一项具有里程碑意义的研究，来自美国华盛顿大学、希腊亚里士多德大学和哈佛大学的研究团队，通过体内造血干细胞（HSC）的Prime Editing（先导编辑）技术，成功治愈了镰状细胞贫血（Sickle Cell Disease, SCD）小鼠模型。这一成果不仅为镰状细胞贫血的基因治疗带来了新的希望，也为基因编辑技术在其他遗传性疾病的治疗中提供了新的思路。

镰状细胞贫血是一种单基因遗传性疾病，其病因在于β-珠蛋白基因（HBB）的第六位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸，导致红细胞在缺氧环境下转变为镰刀状，引发红细胞寿命缩短、血管阻塞和器官损伤等一系列严重病理生理变化。虽然目前的治疗方法能够缓解症状，但无法根治疾病。因此，直接修复突变基因的基因治疗技术被认为是治愈镰状细胞贫血的关键。

在这项研究中，研究团队开发了一种基于Helper-Dependent Adenoviral（HDAd）载体的Prime Editing系统。这种载体能够高效地将Prime Editing组件递送到小鼠的造血干细胞中，并在体内实现基因编辑。

1. 体外验证：细胞水平的基因编辑

在将Prime Editing系统应用于小鼠体内之前，研究团队首先在体外进行了系统的验证，以确保编辑工具的有效性和安全性。

体外细胞实验：研究人员使用人类胚胎肾细胞（HEK293）和红白血病细胞（K562）进行体外实验。实验结果显示，Prime Editing从PE3到PE5max系统，编辑效率显著提高，能够高效地将目标位点的T>A突变修复为正常的GAA序列，甚至在K562细胞中达到了约100%。

图1 细胞系中的 G>A（沉默 PAM 位点）编辑分析

患者细胞的体外实验：为了进一步验证Prime Editing在实际病理条件下的效果，研究人员从镰状细胞贫血患者（SCD）的血液中分离出CD34+造血干细胞，并在体外对其进行Prime Editing处理。结果显示，经过编辑的细胞中，镰状细胞突变的修复率达到了7.5%。此外，经过编辑的细胞在体外分化过程中表现出显著的改善，包括减少氧化应激标志物（ROS）和改善红细胞形态，且仅在一个预测的脱靶位点检测到低水平的编辑，且该编辑不会导致功能改变。

图2 用感染 HDAd-PE5max 的 SCD 患者 CD34+ 细胞进行体外研究

2. 体内研究：小鼠模型的基因编辑

在体外验证Prime Editing系统的有效性后，研究团队将该系统应用于镰状细胞贫血小鼠模型（CD46/Townes小鼠）。

小鼠模型的准备：研究人员使用携带人类CD46基因的转基因小鼠与镰状细胞贫血小鼠（Townes小鼠）杂交，获得能够高效接受HDAd载体的CD46/Townes小鼠模型。这种小鼠模型的红细胞中主要表达镰状细胞血红蛋白（HbS），模拟了人类镰状细胞贫血的病理特征。

体内基因编辑：研究人员通过静脉注射HDAd-PE5max系统，注射后，小鼠接受了O6BG/BCNU药物处理，以选择和扩增成功编辑的HSC。

图3 通过体外造血干细胞转导纠正 SCD 基因突变

体内编辑效果的评估：经过16周的观察，研究人员通过多种方法评估了体内基因编辑的效果

基因水平：通过Sanger测序和NGS分析，发现小鼠体内镰状细胞贫血突变基因（βS）被修复为正常基因（βA）的比例达到了43.6%。经过基因编辑的HSC在次级受体小鼠中能够稳定维持基因修复效果，平均修复率约为40%。

蛋白水平：通过HPLC和质谱分析，发现小鼠血液中镰状细胞血红蛋白（HbS）被正常成人血红蛋白（HbA）替代的比例达到了43%。

图4 使用 HDAd-PE5max 转导体内造血干细胞后，CD46/Townes 小鼠的治疗性编辑状况

表型改善：小鼠的红细胞形态、血液学指标和病理组织学变化均显著改善，镰状细胞的比例从86%降至29.6%。

图5 治疗后第16周，CD46/Townes小鼠的体外和体内表型校正

脱靶效应检测：在小鼠模型中，Prime Editing系统（特别是PE5max）表现出极高的特异性，未检测到明显的脱靶编辑。即使在CIRCLE-seq和Cas-OFFinder预测的潜在脱靶位点中，编辑频率极低，远低于目标位点的编辑效率。

图6 OT 效果分析

这项研究通过体外实验和体内模型的双重验证，本研究突显了Prime Editing技术在治疗镰状细胞贫血方面的显著潜力。研究人员不仅证实了Prime Editing系统的高效与安全性，还为将来的临床应用打下了坚实的基础。随着技术的持续进步和临床试验的深入，基因编辑技术有望成为治愈镰状细胞贫血及其他单基因遗传病的有效工具。

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