文献解读：去除TREX1可增强Cas9介导的同源定向修复效率

【文献解读】CRISPR筛选揭示去除TREX1可增强CRISPR-Cas9介导的同源定向修复效率

CRISPR-Cas9 介导的同源定向修复（HDR）是在目标基因组位点引入精准突变的关键技术。然而，实现高 HDR 效率仍是一项挑战，尤其是在 DNA 修复活性不足的细胞类型中。在大多数人类细胞中，HDR 会在 CRISPR-Cas9 介导的双链断裂（DSB）修复过程中引入外源 DNA 序列，但与非同源末端连接（NHEJ）相比，HDR 的效率明显较低。细胞周期阶段、基因差异表达和细胞背景等因素都会影响 HDR 的效率。此外，DNA 修复基因突变的患者细胞，如范可尼贫血症（FA），会降低 HDR 的效率，从而使基因组编辑的过程更加复杂。

苏黎世联邦理工学院和纪念斯隆·凯特琳癌症中心的研究人员通过全基因组CRISPR筛选，探索了限制CRISPR-Cas9介导的HDR效率的因素，特别是在范可尼贫血症患者的细胞中。他们的研究成果"Removal of TREX1 activity enhances CRISPR-Cas9-mediated homologous recombination"发表在《Nature Biotechnology》（IF：33.1），发现外切酶TREX1显著影响HDR效率，并提出敲除TREX1或使用化学方法保护DNA模板来提高HDR效率的策略。

一、去除 TREX1 可重新激活 FA 患者细胞中的 HDR

该研究采用BFP-to-GFP报告系统，对CRISPR-Cas9介导的HDR效率在FANCA-/-和FANCD2-/-患者的淋巴母细胞系（LCLs）进行了评估。实验中，Cas9 RNPs和ssODN模板被用于将BFP-His151转化为GFP-Tyr151。结果发现，FA-LCLs的HDR效率显著低于野生型，特别是在FANCA-/-细胞中。为揭示影响FANCA-/-细胞HDR的因素，研究者通过CRISPRi和CRISPR RNPs系统，结合FACS技术，进行了全基因组CRISPR筛选，并通过对回收的sgRNAs进行测序来识别关键调控因子。经过慢病毒工程和电穿孔后，约0.5%的GFP+细胞被分离，NGS结果显示TREX1基因在具有高HDR活性的细胞中显著富集。

图 1 TREX1 是 CRISPR-Cas9 介导 HDR 的限制因子

二、TREX1 破坏未受保护的 HDR 模板稳定性

TREX1是一种锚定在ER外膜上的3′-5′外切酶，在抑制细胞膜DNA先天免疫反应过程中，慢性激活环化GMP-AMP合成酶（cGAS）的途径上起着关键作用。TREX1主要降解单链和双链DNA，TREX1的突变与Aicardi-Goutières综合征等自身免疫性疾病有关。在这项研究中，TREX1被确定为限制FANCA-/-细胞中CRISPR-Cas9介导HDR的关键因素。在FANCA-/-和FANCD2-/-细胞中敲除TREX1可重新激活HDR，而过表达的野生型TREX1则几乎完全削减HDR。随后的实验证实，TREX1 与单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）相互作用，在核扩散之前降解细胞质 DNA 模板，从而直接降低了 HDR 的效率。在 HeLa 细胞和 RPE-1 hTERT 细胞中进行的 CRISPR-Cas9 编辑证实了这种外切酶的活性，结果表明保护 ssODN 的 3′ 端可显著提高各种细胞类型中的 HDR 效率，突出了 TREX1 在基因组编辑过程中起到限制模板稳定性的作用。尽管TREX1与ssODN有较强的关联，但它在DNA损伤后并没有转移到细胞核中，这表明它在限制HDR方面的主要作用仍在细胞质中。

图2 TREX1 与 ssODN HDR 模板相互作用

三、TREX1 限制了多种细胞背景下的 HDR 效率，模板保护可规避此现象

在研究TREX1对CRISPR-Cas9介导HDR影响的过程中，研究人员发现TREX1高表达的细胞系（如HeLa）的HDR效率较低，而TREX1表达较低的K562和HEK293细胞则HDR水平较高。通过CRISPRi技术敲除TREX1或使用受保护的ssODN，研究人员在TREX1表达细胞中提升了HDR效率。在原代人类细胞的应用中，受保护的ssODN显著增强了HSPC和活化T细胞的HDR，但对iPSC的影响不大。T细胞中TREX1的敲除提高了未受保护ssODN模板的HDR效率，使其与受保护模板相似。研究结果强调了TREX1作为HDR的关键调节因子，并提出ssODN保护或TREX1抑制策略可以提高CRISPR-Cas9编辑效率。

图3 TREX1在表达 TREX1的原代细胞中抑制HDR

四、HDR 供体类型影响 TREX1 的活性

在该研究中，研究人员不仅研究了单链寡核苷酸（ssODN）模板，还扩展了研究范围，探讨了TREX1对基因组编辑中使用的各种DNA供体类型的影响。他们评估了TREX1对环状和线性双链DNA（dsDNA）及重组腺相关病毒（rAAV）供体的影响，这些供体常用于大型DNA片段的插入。在TREX1抑制型与野生型HeLa细胞中进行的基因编辑实验发现，共价封闭的质粒模板HDR效率不受TREX1抑制的显著影响。但是，当使用线性PCR扩增的dsDNA供体时，TREX1的抑制显著提高了HeLa和Jurkat细胞的HDR效率，这表明具有游离3′末端的DNA供体受TREX1表达水平的影响。K562细胞中TREX1的过表达降低了ssODN模板的HDR效率，进一步证实了TREX1在HDR中的作用。研究人员还研究了TREX1在rAAV供体介导的HDR中的作用，发现TREX1过表达降低了ssODN模板的HDR，但对AAV供体的影响较小，这可能是因为AAV供体能将DNA送入细胞核，理论上避免了ER定位的TREX1的影响。不过，长时间暴露于AAV供体仍然会降低TREX1表达细胞的HDR。这些结果证明了TREX1是CRISPR-Cas9介导HDR的主要调节因子，尤其是对于线性、无保护的DNA供体分子，而化学保护DNA模板3′端可以有效规避TREX1的活性。

图4 TREX1对各种类型的 HDR 供体具有不同的活性

这项研究总体上发现，TREX1作为一种外切酶，对人类细胞中CRISPR-Cas9介导的HDR效率有显著影响，特别是在TREX1水平较高的细胞如FA细胞和多种永生细胞系中。研究提出，去除TREX1或采用化学保护的单链DNA模板，能显著提高HDR效率。该研究强调了保护HDR模板末端以避免TREX1影响的策略，这不仅能提高HDR效率，还能一定程度上增强CRISPR基因编辑的效果，并突出了TREX1作为模板保护生物标记物在CRISPR治疗策略推进中的潜力。