除了PD-L1，还有哪些指标能预测晚期NSCLC免疫治疗效果

对于可能适合免疫治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者，通过免疫组化检测程序性死亡配体 1（PD-L1）表达水平可以预测免疫检查点抑制剂的潜在疗效。作为 CORELAB（晚期非小细胞肺癌免疫检查点抑制剂活性与疗效新型预测性生物标志物研究）项目的一部分，旨在为接受免疫治疗的 NSCLC 患者识别新的预测和预后生物标志物，我们探索了循环肿瘤 DNA（ctDNA）分子检测作为额外预测生物标志物的作用。50 例患者通过靶向 NGS 分析了不同时间点的血浆 ctDNA。基线和治疗 2 个月后的 ctDNA 量与临床结局呈负相关。ctDNA 降低 ≥50% 的患者 OS 显著较高。TP53 和 KRAS 是突变频率最高的基因，KRAS 和/或 TP53 突变患者的预后比未检出突变或检出其他基因突变的患者差。突变频率较低的基因包括 BRAF、EGFR、MAP2K1、MET、NRAS 和 PIK3CA。我们的数据表明，ctDNA 分子检测及其定量评估可以作为动态、实时的预后和预测生物标志物，有助于定期对治疗效果进行分子监测，以支持其他医学检查。

研究背景

非小细胞肺癌（NSCLC）是全球最常见的恶性肿瘤类型之一，也是癌症相关死亡的主要原因。由于缺乏早期诊断工具，且疾病发展过程中症状出现较晚，因此 NSCLC 的预后评估具有挑战性，这限制了治疗选择，通常会导致生存率低。

NSCLC 的治疗以手术切除、化疗、放疗和靶向治疗为主，治疗效果不佳；最近，免疫检查点抑制剂（ICI）也被使用。

逃避免疫系统是癌症生长所需的众多特征之一，而破坏免疫检查点是实现这一逃避的途径之一，这为治疗干预提供了机会。临床上最为相关的两个检查点，细胞毒性 T 淋巴细胞抗原 4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白（PD1），充当抗癌免疫反应的制动器。

免疫检查点抑制剂抗 PD1/PD-L1 抗体单独使用或与抗 CTLA-4 抗体联合使用，在转移性癌症（如转移性黑色素瘤）的治疗中得到越来越多的应用，提高无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。大量实验研究表明，免疫检查点抑制剂比传统疗法更安全、更有效，并为晚期 NSCLC 患者的临床治疗提供了更好的指导。免疫治疗作为单药治疗（一线和二线，在 PD-L1 表达 ≥50% 的情况下）或免疫治疗联合化疗（一线，在 PD-L1 表达 <50% 的患者中）后，5 年 OS 率在未经选择的患者中为 20%，在 PD-L1 高表达的患者中高达 40-50%。

不幸的是，许多患者未从免疫治疗中获益。因此，识别 NSCLC 患者 ICIs 治疗的预测性生物标志物不仅有助于选择能从免疫治疗中获益的患者，还可以限制无效治疗。

免疫组化目前被评估并批准作为评估组织 PD-L1 表达的参考方法，在包括 NSCLC 在内的多种实体瘤中，作为免疫检查点抑制剂疗效预测因子。使用肿瘤 PD-L1 表达作为生物标志物已被广泛研究。一般来说，在所有肿瘤类型中，PD-L1阴性肿瘤患者接受抗PD-1/PD-L1治疗的缓解率为0%-17%，而肿瘤表达PD-L1的患者的缓解率为36%-100%。然而，PD-L1 作为生物标志物的广泛应用和标准化受到实践中使用的不同检测方法（免疫组织化学（IHC）），流式细胞术，vs mRNA 表达）的限制。此外，对于 PD-L1 阳性表达的临界水平尚未达成共识。此外，许多肿瘤不仅恶性细胞表达 PD-L1，而且肿瘤微环境中的非恶性细胞也表达。最后，PD-L1 表达仅适用于接受 PD-1/PD-L1 抑制剂治疗的患者，不适用于其他类型的免疫疗法。

最近，有研究提出，新的生物标志物，包括肿瘤突变负荷（TMB）和血浆来源的循环肿瘤 DNA（ctDNA），作为 NSCLC 和其他实体瘤对免疫治疗反应和疗效的预测因子。

ctDNA属于液体活检（LB）这一更广泛范畴，液体活检包括其他肿瘤来源的循环生物标志物，例如循环游离 RNA（非编码，miRNA 和信使 RNA）、细胞外囊泡（外泌体和癌小体）、肿瘤诱导血小板、循环蛋白；循环免疫细胞和免疫系统成分以及血液中的循环微生物组。LB 概念还包括其他生理液体，如脑脊液、尿液、骨髓、痰液和唾液。已经开发了多种基于 ctDNA 的技术，包括下一代测序（NGS）评估广泛突变，拷贝数变化和扩增模式。通过 NGS 对 ctDNA 进行基因检测已经是多种肿瘤类型临床实践中常规不可或缺的组成部分。在某些晚期恶性肿瘤（例如 NSCLC）中，ctDNA 主要作为组织基因检测的补充，用于选择生物标志物指导的一线治疗。而在接受免疫检查点抑制剂的患者中，ctDNA 评估显示出预测和预后价值。血浆 TMB 和组织 TMB 的一致性已经确定，除了在缺乏组织时作为非侵入性生物标志物外，血浆 TMB 可能还有其他优势，例如全面捕获肿瘤基因组异质性，包括评估原发和转移部位。在临床上，基于 ctDNA 的基因检测也作为实时工具，在接受靶向治疗的患者中用于监测新出现的耐药突变，这具有直接的临床影响，能够基于不断演变的肿瘤生物学改变治疗，做出治疗决策。除了这些应用之外，以微创方式重复进行 ctDNA 评估的能力提供了一个独特的机会，可以使用早期治疗期间 ctDNA 变化来实时评估治疗反应和结局。

ctDNA 作为生物标志物的另一个关键应用是使用基于血浆的 ctDNA 水平变化进行分子反应评估。ctDNA 清除已被证明是免疫治疗获益的预测指标，相反，ctDNA 未降低与进展风险增加相关。

本研究展示了参加 CORELAB（晚期非小细胞肺癌免疫检查点抑制剂活性与疗效新型预测性生物标志物研究）项目的晚期 NSCLC 患者，治疗前后靶向 NGS ctDNA 纵向分析的初步数据，包括 ctDNA 定量和突变分析。CORELAB 是一个为期 4 年的多中心项目，旨在探索新的循环（ctDNA）和组织生物标志物（TMB 和血管正常化（VN））作为晚期 NSCLC 患者检查点抑制剂活性和疗效的预测因素的潜力。

在 50 例患者队列中，在免疫治疗开始前和开始后 2、4、6 和 12 个月采集每位患者的血液样本，直至疾病进展，通过专门的靶向 NGS panel评估患者的突变状态，分析 ctDNA 水平变化，评估早期肿瘤对 ICI 反应，作为 OS 替代指标。

研究结果

患者的临床病理特征

在CORELAB研究中，根据临床实践，招募了适合接受免疫检查点抑制剂治疗（一线/二线治疗）的晚期（III/IV期）NSCLC 患者。在 ICI 治疗开始前（时间 0、T0）以及可行的情况下，在治疗 2、4、6 和 12 个月后（时间 1，T1；时间 2，T2；时间 3，T3；时间 4，T4），或在疾病进展（TP）时，采集血液样本。本研究分析的患者队列是参加 CORELAB 项目的前 50 例患者。NSCLC 患者队列的中位年龄为 70 岁（范围 48-83 岁）；66% 的患者为男性，34% 为女性。38 例（76%）患者是当前或既往吸烟者，12 例（24%）从未吸烟。41 例肺癌（82%）为腺癌，5 例（10%）为鳞状细胞癌，4 例（8%）为其他组织学类型。所有患者均接受帕博利珠单抗作为免疫治疗。32% 和 22% 的患者分别接受过手术或化疗；5 例患者这两种治疗均接受过。患者的基线特征总结于表 1 中。

表1

总循环游离DNA（cfDNA）

所有血浆样本均成功提取 cfDNA。基线（T0）的中位 cfDNA 水平为 13.62 ng/mL（范围：3.75-208.50）。40 例患者还评估了第一个后续时间点（T1）的 cfDNA 水平；治疗 2 个月后，中位 cfDNA 水平为 10.93 ng/mL（范围：4.29-56.70）。

将基线时的 cfDNA 水平与2个月后的 cfDNA 水平进行比较，4/40（10%）例患者降低至少 50%，13/40（32.5%）例患者升高至少 50%，23/40（57.5%）例患者没有变化（降低或升高小于 50%）。

总 cfDNA 量与临床结局无关。

ctDNA和检测到的变异

使用靶向 NGS panel成功对来自 NSCLC 患者的 50 份基线和 40 份后续血液样本的cfDNA 进行测序，检测肺肿瘤来源的 cfDNA。

基线（T0 样本）患者突变状态如下：对于panel覆盖的11个基因（ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、KRAS、MAP2K1、MET、NRAS、PIK3CA、ROS1 和 TP53），19/50（38%）例患者未检测到变异，31/50（62%）例患者检测到突变；22/50（44%）只有一个突变，6/50（12%）有两个突变，3/50（6%）有两个以上突变。突变频率最高的两个基因是 TP53 和 KRAS，分别有 17 个和 14 个突变。TP53 和 KRAS 分别在 11/50（22%）和 9/50（18%）的患者中发生突变，4/50（8%）例患者基线时同时携带这两个基因突变。panel包含的其他基因：BRAF、EGFR、MAP2K1、MET、NRAS 和 PIK3CA 也检测到突变，频率较低（表 2）。

表2

在 50 例患者中，40 例有第一个后续时间点（T1）的分子检测数据：在治疗2个月后，26/40（65%）未检测到panel基因变异，14/40（35%）突变阳性。6/40（15%）携带 1 个变异，4/40（10%）携带 2 个变异，4/40（10%）携带 2 个以上变异。在 T1 时，3/40（7.5%）存在 KRAS 基因突变，3/40（7.5%）存在 TP53 突变，3/40（7.5%）这两个基因均发生突变。还观察到 BRAF、EGFR、MAP2K1、MET、NRAS 和 PIK3CA 突变（表 2）。特定转移部位（如脑或肝脏）的存在与基线 ctDNA 值无关（分别为 p = 0.793 和 p = 0.447）；相反，具有 >2 个转移部位的患者具有显著较高的 ctDNA 基线值，反映了不同的肿瘤负荷（p = 0.004）。

基线（T0）和免疫治疗2个月后（T1）的ctDNA

在 40 例患者中，16 例（40%）在基线和免疫治疗2个月后未检测到变异；14/40（35%）患者从 T0 到 T1，ctDNA 水平降低至少 50%，其中 10 份 T1 样本的 ctDNA水平降至我们方法的检出限以下。

在 5/40（12.5%）例患者中，ctDNA 水平上升至少 50%（其中 1 例在基线时为野生型），在 5/40（12.5%）例患者中，ctDNA 水平在两个时间点之间保持稳定（变化低于 50%）（图 1）。

图1

ctDNA与临床结局和生存的相关性

将这两个时间点的 ctDNA 值与临床结局相结合进行统计分析，结果显示，无影像学反应患者（NRR，38%，n = 19）的血浆 ctDNA 水平高于影像学反应阳性的患者（RR，n = 31）。无论这两个时间点 T0（图 2，图 A，NRR n = 19，RR n = 31）和T1（图 2，图 B，NRR n = 10，RR n = 30，p 值分别为 0.013 和 0.019）检测到的变异如何，均显示这一结果。只有在 T0 和 T1 均未检测到 ctDNA 的患者才显示影像学完全缓解。

图2

此外，T1 和 T0 之间的 ctDNA delta 值（∆ctDNA =（ctDNAT1 − ctDNAT0）/ctDNAT0）与临床结局相关（在影像学反应方面）（图 2，图 C；NRR n = 10，RR n = 30，p 值 0.047）。

野生型患者（未检测到变异的患者）似乎比检测到至少一个等位基因变异的患者生存状况更好，尽管 OS 分析未达到完全的统计学意义（p = 0.06）。

关于分子反应与患者生存之间的关联，根据 T0-T1 ctDNA 动力学将突变患者分为两组（即 ctDNA 降低的患者与 ctDNA 稳定或升高的患者），进行对数秩检验分析，结果显示，T0 和 T1 之间 ctDNA 降低 ≥50% 的患者的 OS 和 PFS 显著较高（p 值分别为 0.042 和 0.004）（图 3A）。

图3

基线时检测到 KRAS 和/或 TP53 突变的患者（n = 24）的 OS 比检测到其他基因突变的患者（n = 8）和未检测到基因突变的患者（n = 18）差（p 值 0.036），无论 PD-L1 表达如何（图 3B）。在 PFS 方面未观察到这些结果（p = 0.383）。KRAS和TP53突变的预后价值进一步得到证实，在我们的研究人群中，它们与基线脑/肝转移的发生率较高或转移部位数量较多无关（KRAS的p值分别为0.158、0.100、0.584，TP53的p值分别为0.664、0.103、0.666）。

PD-L1 表达水平与患者的临床结局无关（OS p = 0.24）；有趣的是，具有 KRAS 和/或 TP53 突变且 PD-L1 表达> 50% 的患者（占所有患者的 22%）显示出良好的结局（OS），与 PD-L1 表达低于 50% 的患者显著不同（log-rank 检验，p < 0.001）。

液体活检纵向监测

图4展示了我们队列中一位患者10个月的纵向监测情况。该患者被选作通过ctDNA评估进行监测的实例，从基线开始直至疾病进展，每两个月评估一次。基线时，NGS 突变分析显示一个 TP53 变异（TP53 p.R273P），VAF% 为 35.65%。T1 时未检测到该突变，而 T2 时观察到定量上有限的新上升（VAF% 1.77）。此外，在疾病进展（TP）时，免疫治疗开始后 184 天，VAF% 进一步升高至 6.64%。

图4

关于与临床数据的关联，患者在免疫治疗 100 天后出现影像学反应（疾病稳定），在此之前，T1 时间点 ctDNA 阴性。患者在 T0 起 288 天死亡，此前疾病进展在分子层面也得到证实，表现为ctDNA显著上升（图 4）。

讨 论

ctDNA 分析正成为一种新的非侵入性工具，用于疾病监测和评估治疗反应，但在免疫治疗的背景下，其具体应用仍有待明确。

在本研究中，我们评估了基线时血浆 ctDNA 的存在及其突变谱，以及治疗开始 8 周后出现的变化。在 50 例接受 ICI 的 NSCLC 患者中，通过能够识别 SNV 和小 INDEL的靶向 NGS 策略评估患者的血浆突变状态，并提供了与影像学反应和结局的相关性。

本研究纳入了一部分参加 CORELAB 项目的患者，评估了 ctDNA 突变分析作为晚期 NSCLC 患者检查点抑制剂活性和疗效的预测因子。目前为止，106 例患者在基线和随后的治疗周期每 2 个月收集一次血液样本，直至肿瘤进展。

为此，我们特别关注工作流程的分析前阶段，采用符合国际标准 ISO 20186-3（体外分子诊断检测 - 静脉全血检测前过程规范 - 第2部分：游离DNA的分离）的程序，使用经过认证的含有用于 cfDNA 分析的特定稳定剂的采血管，且事先已测试过其对下游应用的适用性。此外，我们明确了储存和运输条件，采用标准化的自动化 cfDNA 分离方案，以及评估分离的 cfDNA 数量和质量的程序。事实上，缺乏标准化方案是阻碍 cfDNA 分析在常规临床实验室应用的障碍之一；因此，迫切需要改进分析前步骤以获取高质量的 cfDNA。

所有血浆样本均成功处理，提取了 cfDNA。未发现总 cfDNA 数量与临床结局显著相关，大多数样本在治疗的前 2 个月内没有随时间变化。事实上，尽管据报道癌症患者的 cfDNA 通常高于健康受试者，但其作为预测或预后生物标志物的使用仍然存在争议。Peng 表明，治疗前cfDNA与中性粒细胞/淋巴细胞比值（NLR）较低的晚期 NSCLC 患者预后较好；相比之下，在第三次治疗（包括免疫治疗）前 cfDNA 浓度升高是晚期 NSCLC 患者疾病进展的独立因素。这些结果可能有助于识别高危患者和指导治疗策略。然而，在我们的研究中，可能是由于患者数量有限，未发现血浆中总 cfDNA 浓度具有预测或预后作用的证据。除了患者数量之外，另一个可能的原因与用于 cfDNA 定量的方法类型有关；事实上，尽管 cfDNA 在肿瘤学中的重要性日益增加，但对 cfDNA 分析方案还没有普遍共识，需要标准化分析前和分析程序才能在不同实验室获得准确和可重复的结果。

对于 ctDNA，我们使用针对肺癌基因组分析的靶向11基因panel，将每个样本中ctDNA量估算为观察到的每个肿瘤相关体细胞突变的所有VAF之和。通过对获得的ctDNA量进行分析，可以识别具有分子反应的患者（定义为T0和T1之间VAF降低≥50%）；我们发现 35% 的患者 ctDNA 水平降低至少 50%，并且这种分子反应与 OS（p = 0.042）和治疗获益（影像学反应，p = 0.047）显著相关。这些数据与其他研究一致。Guilbert 等人对 86 例接受 PD-1 抑制剂作为二线或以上治疗的 NSCLC 患者进行了回顾性研究，报告通过血浆靶向测序评估的 ctDNA 变化可以预测对治疗的反应；类似地，有研究在一线接受基于帕博利珠单抗的治疗的患者中使用 NGS 评估 ctDNA 变化，发现早期 ctDNA 变化先于影像学反应，并且与免疫治疗的临床结局相关。

影像学反应也与基线和治疗 2 个月后的 ctDNA 量显著相关，即使在基线时，ctDNA 也与临床反应相关，ctDNA 水平较低的患者具有更好的客观缓解率。基线 ctDNA 的这种潜在预测作用需要在更大的患者队列中得到验证，但它可能在免疫治疗开始前为临床提供早期且有用的指示。此外，治疗后 2 个月与基线之间的 ctDNA delta 值也与影像学反应方面的临床结局相关。这些初步数据似乎证实，独立于检测到的变异和 ctDNA 的绝对量，其下降与更好的结局相关。

我们 62% 的患者基线时检测到 ctDNA 等位基因变异；未检测到变异的患者似乎有更好的结局，但 OS 分析显示两组之间没有统计学显著差异。我们认为缺乏统计学显著性可能是由于我们的NGS检测包含的基因数量有限，因为Thompson等人使用更广泛的、非肺癌特异性 panel，在NSCLC患者的ctDNA中检测到更高比例（93%）的变异，这可能是识别的总体变异比例不同的原因。

在我们的 NGS 评估包含的 11 个基因中，TP53 和 KRAS 突变频率最高，BRAF、EGFR、MAP2K1、MET、NRAS 和 PIK3CA 突变频率较低。检测到的变异反映了晚期 NSCLC 的典型突变图谱，与COSMIC（癌症体细胞突变目录）数据库一致。

与没有检测到变异或检测到其他基因突变的患者相比，具有 KRAS 和/或 TP53 突变的患者显示出最差的结局（log-rank 检验分析，p = 0.036）。在接受 ICI 治疗的 NSCLC 中，KRAS 和 TP53 的预测或预后作用仍存在争议。Pavan 及其同事发现，与 TP53 野生型患者相比，携带 TP53 改变的患者 OS 显著更短，并且 TP53/STK11 或 KRAS/STK11 或 TP53/KRAS/STK11 共突变对 OS 有负面影响。与我们的研究类似，在他们的研究中，所有亚组分析也未显示对免疫治疗 PFS 的这种影响。另一方面，其他研究观察到相反的趋势，报告 KRAS 和 TP53 突变可作为指导肺腺癌免疫治疗的阳性预测因子，促进 PD-L1 表达，增加肿瘤免疫原性。

有趣的是，对 KRAS 和/或 TP53 突变且 PD-L1 表达> 50% 的患者（有限数量的患者，仅占我们病例的 22%）的 OS 分析显示结局较好，与血浆中存在相同突变但PD - L1表达低于50% 的患者有显著差异（对数秩检验 p < 0.001）。

其他研究在 PD-L1 高表达（≥50%）肺癌人群中观察到了非常相似的结果，KRAS和TP53共突变具有阳性预后价值。

在我们的研究中，当考虑所有等位基因变异与PD - L1水平的关系时，未发现统计学显著差异，这进一步支持了KRAS/TP53变异的重要性。综上所述，尽管我们关于这一主题的研究结果可能会受到样本数量有限的影响，且应主要视为提出假设，但这些结果证实了 TP53 和 KRAS 突变 NSCLC 的侵袭性，而它们对免疫治疗的预测价值仍不明确。

我们对一个患者亚组进行了随时间变化的 ctDNA 突变分析（基线、治疗 2 个月和 4 个月后以及疾病进展时），并以一位患者的结果为例，说明液体活检在患者长期监测中的潜在应用。在这项纵向研究中，免疫治疗开始和 2 个月时间点之间 ctDNA 水平降低先于影像学反应；此外，在疾病进展时观察到 ctDNA 量显著增加，提示 ctDNA 是一种动态生物标志物，可对治疗效果进行实时分子监测，来支持其他医学检查，例如影像学评估。值得注意的是，这名 TP53 突变患者的肿瘤组织显示 PD-L1 阴性，与先前研究结果一致，从免疫治疗开始起的生存期较短。

总之，本研究数据表明，在 III/IV 期 NSCLC 患者中，除了 PD-L1 表达水平外，ctDNA 的定量和定性数据可能是一种动态且可靠的工具，用于预测和监测对 ICIs 的反应。此外，基线 ctDNA 水平或许有助于筛选出可能从治疗升级策略中获益或需要治疗改进的患者。KRAS 和 TP53 突变以及与 PD-L1 相结合的潜在预测作用，可能是接受 ICI 治疗的 NSCLC 患者管理的一个重要方面。这些结果需要在更大的病例系列中得到确认和验证。

参考文献：

Gelmini S, Calabri A, Mancini I, Comin CE, Pasini V, Banini M, Scotti V, Pinzani P. Circulating Tumor Cell-Free DNA as Prognostic Biomarker in Non-Small Cell Lung Cancer Patients Undergoing Immunotherapy: The CORELAB Experience. International Journal of Molecular Sciences. 2025; 26(2):611. https://doi.org/10.3390/ijms26020611

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