CRISPR基因编辑联合磁热激活：助力肿瘤精准医学的新策略

在当前的癌症治疗策略中，诱导肿瘤细胞凋亡是关键一环。肿瘤细胞通过抑制正常的凋亡机制，实现了不受控制的增殖。基因编辑技术，尤其是CRISPR-Cas9系统，因其能够精准调控细胞功能而备受关注。然而，如何在体内实现该系统的精准控制仍然是一个挑战。结合磁热疗法，利用其高渗透性和低毒性，通过控制热效应与CRISPR-Cas9技术协同作用，可以开发出一种新型的肿瘤治疗方法。这种磁热与基因编辑相结合的疗法展现出显著的治疗潜力，为肿瘤精准医学提供了新的策略。

近期，中国科学院上海硅酸盐研究所在《Journal of Nanobiotechnology》（1区Top，影响因子：10.6）期刊上发表了一篇题为"Magnetothermal-activated gene editing strategy for enhanced tumor cell apoptosis"的研究论文。这项研究提出了一种全新的基因编辑策略--磁热激活基因编辑技术，并开发了一种创新的磁热激活CRISPR-Cas9基因编辑系统。该系统精准地靶向肿瘤细胞的HSP70和BCL2基因，显著增强了肿瘤细胞的凋亡，为癌症治疗提供了新的可能性。

磁热疗法以其高渗透性和低毒性成为理想的治疗手段，但单独使用难以完全诱导肿瘤细胞凋亡。将磁热疗法与CRISPR-Cas9系统结合，能够在中等温度下提高肿瘤细胞凋亡率。研究开发了一种磁热纳米粒子平台，利用交变磁场控制的热效应与CRISPR-Cas9系统的协同作用，靶向HSP70和BCL2基因，从而增强治疗效果，并减少对正常组织的损伤。这种磁热-基因编辑疗法显示出在肿瘤精准医学中应用的良好潜力。

一、纳米基因编辑系统MPDH的制备与特征

为了制备MPDH纳米基因编辑系统，研究人员首先采用种子介导法合成了磁热纳米粒子MNPs（ZnCoFe2O4 @ ZnMnFe2O4）。这些纳米颗粒的尺寸约为15.3nm，具有优异的单分散性。通过使用C18-PEI对纳米颗粒表面进行修饰，研究人员提高了细胞摄取效率和质粒DNA的负载能力，从而获得了能够在水和PBS中稳定分散的MP纳米颗粒。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和热重分析（TGA）证实了表面改性的成功，为后续的生物医学应用提供了坚实的基础。MPDH纳米基因编辑系统通过静电吸附质粒，有效结合Cas9，并展现出稳定的尺寸和分散性。

为了评估MPDH纳米粒子的磁热性能，研究人员在1.7 mT的安全磁场强度下进行了测试。MPDH的饱和磁化强度为75.4 emu/g，显著高于传统的铁或氧化铁磁性纳米颗粒。在1.35 kA·m的交变磁场下，MPDH的温度在4 mg/mL浓度时可以从28°C迅速升高至42°C，适合用于轻度磁热治疗。红外热成像显示了MPDH的温度-时间分布，通过循环实验和长期监测证明了其磁热性能的稳定性和重复性，温度稳定在42°C左右。这些结果表明，质粒可以通过高效的pH响应和热响应进行释放，为肿瘤靶向基因编辑和精准医疗提供了理想的特性。

图1纳米基因编辑系统MPDH的制备与表征

二、体外温和磁热驱动的抗凋亡基因组破坏

在体外治疗研究中，研究人员首先使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 评估了MP/MPD/MPDH纳米颗粒的细胞毒性。结果显示，这些纳米颗粒在不同浓度下对4T1细胞几乎没有显著毒性，表明其良好的生物相容性。特别是MPFD处理的4T1细胞在200-800 μg/mL浓度范围内显示出更高的细胞活性，可能由于透明质酸（HA）中和了聚乙烯亚胺（PEI）表面的过量正电荷。MPFD纳米颗粒对正常C166小鼠内皮细胞也表现出较低的细胞毒性。 进一步研究发现，MPDH纳米颗粒在4T1细胞中的内化效率高于C166细胞，表明HA修饰增强了MPDH的靶向性。共聚焦成像显示，纳米颗粒逐渐与溶酶体共定位，并且PEI的质子海绵效应有助于内体逃逸，从而促进质粒释放进入细胞核。

在磁热触发基因编辑方面，使用HSP70启动子驱动的EGFP质粒评估转染效率时，磁热处理组的EGFP荧光显著强于未经磁热诱导的组。流式细胞术结果表明，轻度磁热组的EGFP阳性率为52.6%，磁热处理20分钟后，EGFP阳性细胞比例达到最高（61.4%）。这表明磁热控制CRISPR-Cas9系统能够精确调控基因编辑，减少非特异性编辑事件。

图2 MP/MPD/MPDH 纳米颗粒的细胞毒性的评估

三、温和磁热联合基因编辑的治疗潜力的探索

在4T1肿瘤细胞的基因编辑中，结合轻度磁热的处理显著增强了基因编辑效果，促进了肿瘤细胞的凋亡。磁热处理组（MH）和MPDH联合磁热处理组（MPDH+MH）的细胞凋亡率显著高于对照组，其中MPDH+MH组的凋亡率达到95.8%。此外，CCK-8测定结果显示MPDH+MH组显著抑制了肿瘤细胞增殖，显示了其良好的治疗潜力。这些结果表明，靶向肿瘤凋亡相关基因的磁热疗法可以有效地上调肿瘤细胞凋亡并下调增殖。

研究人员通过Western blot分析了MPDH+MH在诱导细胞凋亡中的作用，发现MPDH+MH处理组中促凋亡蛋白Bax、caspase-3和细胞色素C表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP70表达下调。MPDH+MH组的促凋亡蛋白表达最高，抗凋亡蛋白表达最低。温和磁热和CRISPR-Cas9基因编辑系统在诱导肿瘤细胞凋亡中表现出显著的协同效应，通过双重调控HSP70和Bcl-2实现，磁热激活了热休克反应通路，降低了HSP70和Bcl-2的表达，CRISPR-Cas9系统进一步降低了相关基因表达。这种机制促进了细胞色素C的释放和凋亡信号通路的激活。T7核酸内切酶I（T7E1）测定法显示MPDH+MH联合处理组的HSP70和BCL2基因组突变频率显著高于单独处理组，qRT-PCR结果也证实了MPDH+MH组HSP70和BCL2 mRNA表达显著降低。这表明磁热激活的纳米基因编辑系统能够高效、准确地编辑肿瘤相关基因，为体外基因治疗提供了一种潜在的新策略。

图3 磁热激活的纳米基因编辑系统编辑肿瘤相关基因的潜力评估

四、磁热介导的基因编辑在体内诱导肿瘤凋亡

为了评估磁热增强CRISPR/Cas9基因编辑系统的体内肿瘤凋亡诱导和生长抑制能力，研究人员利用4T1荷瘤小鼠模型评估。小鼠随机分为对照组、MPDH治疗组、磁热治疗（MH）组和MPDH联合轻度磁热疗（MPDH+MH）组。经过MPDH纳米颗粒注射后，MH和MPDH+MH组的小鼠接受了为期三天的轻度磁热治疗。结果显示，MPDH+MH组显著抑制了肿瘤生长，肿瘤细胞死亡率高，肿瘤大小显著减少，且在治疗第35天生存率达到80%，而MH组仅为30%。所有治疗组的体重变化无显著差异，表明对小鼠整体健康影响较小。

图4 磁热介导的基因编辑的体内抗肿瘤疗效

为了验证治疗效果，研究人员对肿瘤组织进行了苏木精和伊红（H&E）染色和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色。正如H&E染色和TUNEL分析所揭示的那样，与其他治疗组相比，MPDH + MH组在肿瘤组织中的凋亡和坏死细胞数量显着增加。5Ki-67抗体染色也证实了MPDH+MH组对肿瘤细胞增殖活性的显著抑制，从而验证了MPDH+MH的显著肿瘤抑制作用。

为了评估MPDH的体内基因编辑效果，研究人员使用Western blot分析和深度测序法对肿瘤组织中的HSP70和BCL2表达进行了评估。结果显示，MPDH + MH治疗组的HSP70和BCL2蛋白表达水平显著降低，mRNA分析进一步确认了基因的有效敲低。此外，通过DNA测序，MPDH + MH组的HSP70和BCL2基因突变频率分别为7.6%和27.8%。治疗后，进行了小鼠的全血细胞计数、血清生化分析以及器官的组织病理学检查，未发现明显的器官损伤或炎症，血液和肝肾功能指标均正常。这些结果表明，MPDH结合磁热的基因编辑治疗系统在治疗过程中具有良好的生物安全性。

图5 磁热联合基因编辑治疗系统的生物安全性评估

综上所述，这项研究创造性地设计了一种热响应型纳米系统，利用磁热效应在肿瘤细胞中实现CRISPR-Cas9系统的精确基因编辑。通过外部磁场诱导的温和加热，该系统能够调控HSP70和BCL2等关键蛋白的表达，从而对癌细胞进行针对性的杀伤。这种方法在保护周围健康组织的同时，显著提高了肿瘤治疗的效率和特异性。这一CRISPR-Cas9技术的进展为肿瘤治疗提供了一种新的精准医学策略，并为临床应用带来了潜在的前景。

原文链接： https://doi.org/ 10.1186/s12951-024-02734-8

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