胶原蛋白基材料体外降解及检测方法研究综述

1. 引言

胶原蛋白是一种天然提取物，呈纤维状结构，在人体中含量丰富，它具有生物可降解、生物相容性好、组织再生功能以及无细胞毒性等优点。目前胶原蛋白基材料被广泛地作为生物医用材料如胶原蛋白植入剂、胶原蛋白海绵、胶原蛋白补片等使用[1]。胶原蛋白降解表征是安全风险评估的重要内容，目前胶原蛋白类植入医疗器械降解表征主要参考GB/T 16886.9和GB/T 16886.13，但缺乏具体评价方法标准。本文基于已有研究资料重点对胶原蛋白基材料体外降解检测方法体系进行概述，分析当前胶原蛋白基材料体外降解检测技术水平，并对胶原蛋白基材料检测标准制定思路进行展望分析，旨在为胶原蛋白基材料降解相关标准制定完善提供理论参考，促进胶原蛋白基材料类产品科学监管体系的发展完善。

2. 胶原蛋白概述

2.1 胶原蛋白的结构与功能

胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质，约占蛋白质总量的30% [2]。目前已经发现了至少28种不同类型的胶原蛋白，分别以罗马数字I-XXVII 进行命名，每种类型都由三条多肽链形成的同源三聚体和异源三聚体组成[3]。所有胶原蛋白的结构标志是它们的三螺旋--由3条左手螺旋（二级结构）的多肽链组成，它们相互缠绕形成一个在中心分子轴周围的右手螺旋（三级结构），每条链都包含一个或多个以重复氨基酸基序 Gly-X-Y 为特征的区域[4]， 三条原胶原肽链可通过链间氢键彼此盘绕形成稳定的三螺旋结构[5]。根据结构和功能不同，胶原蛋白又分为纤维状胶原蛋白，网架结构形成胶原蛋白等不同类型[6]。其中，纤维状胶原蛋白占人体胶原的80-90%，是支撑动物皮肤、骨骼、软骨、血管中抗拉强度的主要蛋白[7]。胶原蛋白是所有结缔组织的主要结构元素，也存在于几乎所有实质器官的间质组织中，例如皮肤、骨骼、软骨、韧带、血管、内脏器官、牙齿等。胶原蛋白的分布和类型的多样性使其在结构和功能上发挥重要作用，是维持组织完整性和功能的关键成分[6]。

2.2 胶原蛋白在医疗领域的运用

胶原蛋白的三螺旋构象使其有较好的理化性质和生物学活性的基础，因而具有较好的生物相容性和生物可降解性[1]。胶原蛋白在医疗领域的应用非常广泛，包括组织工程（用作支架材料，帮助细胞生长和组织再生）、创伤愈合（提供湿润的愈合环境，加速细胞迁移和再生，减少疤痕形成）、美容医学（胶原蛋白注射被用于填充面部皱纹和凹陷，恢复皮肤的弹性和紧致度）、骨骼修复（作为骨替代材料，促进骨细胞的生长和骨的再生）、血管修复（促进血管内皮细胞的生长，帮助修复损伤的血管）、药物递送载体（包裹药物并控制其释放速率，提高药物的生物利用度）、牙科领域（用于牙龈再生和牙齿植入手术中，促进软组织和骨组织的愈合）等。胶原蛋白的降解主要取决于自身的化学性质和植入部位的生物微环境，其中交联程度和植入部位是两个影响胶原蛋白基质材料体内降解的重要因素。不同结构的交联剂在胶原分子中引入的交联点位置不同，也对胶原蛋白的降解性能也会产生不同的影响[8,10]。天然胶原蛋白在体内降解周期短，而通过化学交联可延长胶原降解周期，同时可提高其机械强度。

3. 胶原蛋白体外降解表征

3.1 胶原蛋白体外降解模型

胶原蛋白在体外降解模型一直备受关注，主要涉及酶和非酶机制包括酶促降解、化学降解、物理降解以及细胞介导的降解等。以酶降解中的胶原酶降解为例，胶原酶是唯一可以在体内特异性水解胶原的蛋白酶，在胶原三螺旋区的特殊位点上具有切割作用。胶原酶降解胶原蛋白有一个渗透附着的过程，在这个过程中，降解液向胶原蛋白逐层渗透，胶原酶不同程度地沉积在纤维层之间、纤维之间以及纤维上，并向周围扩散。当胶原酶接触到胶原蛋白肽链上的特定位点时将肽链切断，当被切断的肽链较多时，肽链就会从纤维上脱落到降解液中，完成降解的过程[1,12]。下表1列举了胶原蛋白体外降解的主要模型。

表1 胶原蛋白体外降解模型

这些不同的降解模型可以帮助研究人员了解胶原蛋白在不同条件下的稳定性、降解速率以及降解产物对细胞和组织的影响，各有优缺点，通常根据研究目的和产品应用选择合适的模型[1,9]。通过监控降解过程的产物和速率，深入地理解胶原蛋白的降解机制，对于优化胶原蛋白基材料的性能、评估其生物相容性以及开发新的生物医学应用具有重要意义[11]。

3.2 胶原蛋白体外降解检测方法

在胶原蛋白降解模型实验中，研究人员通常会采用多种技术来检测和分析胶原蛋白的降解过程。主要涉及胶原蛋白的鉴别和胶原蛋白的含量测定，例如通过观察胶原蛋白物理外观形态变化、观察胶原蛋白三维螺旋结构变化、直接或间接测定胶原蛋白含量、降解液含量分析等手段[13]，来监测和分析胶原蛋白的降解过程。下表2分别罗列了目前胶原蛋白体外降解检测方法。

表2 胶原蛋白体外降解检测方法

3.2.1 失重法

方法原理与步骤：通过测试降解前后胶原蛋白的重量差异直观反映胶原蛋白的讲解程度。其失重率计算公式如下：失重率＝（降解前的重量－降解后的重量）÷降解前的重量×100％。

3.2.2 紫外-可见光谱分析

方法原理与步骤：通过测量胶原蛋白降解液在特定波长下的吸光度变化，来监测胶原蛋白的降解过程。比尔-朗伯定律(eer-Lambert Law)常用于定量分析。紫外分光光度法通过测定溶液的吸光度，以波长和吸光度的关系绘制待测物的吸收谱图，确定λmax和λmin，再将一定波长范围内待测物的光谱与对照光谱比较或测定两个特定波长处的吸收值来鉴别物质。在测定胶原蛋白的含量时，可以在230 nm下测定已知胶原蛋白浓度溶液的吸光度，绘制曲线，再将待测试样在230 nm处测定其吸光度，根据标准曲线得出胶原蛋白降解情况[14]。

3.2.3 羟脯氨酸比色法

方法原理与步骤：羟脯氨酸是胶原蛋白的特异性氨基酸，占胶原蛋白氨基酸总量的10％，由测得的羟脯氨酸量可较为准确地定量表示降解的胶原蛋白量。胶原蛋白在一定的降解条件下（例如酶降解、酸降解）会释放出羟脯氨酸，再利用氯胺T氧化羟脯氨酸，生成含有吡咯环的氧化物，剩余的氯胺T用高氯酸去除，在一定温度下该氧化物会与对二氨基苯甲醛反应，生成红色的特征产物，在558 nm处检出，与标准曲线比较定量，即可确定羟脯氨酸的浓度，从而计算降解的胶原蛋白的含量[14]。

3.2.4 色谱分析

方法原理与步骤：高效液相色谱法应用高压输液系统，将极性不同的单一溶剂或混合溶剂、缓冲液等流动相泵入色谱柱，色谱柱中装有固定相，各组成成分被分离后进入检测器进行检测，以此对样品进行分析。按照《中国人民共和国药典》（2020年版）"色谱法"的"分子排阻色谱法"测定，可计算得出胶原蛋白的分子量，根据降解前后的分子量变化判断胶原蛋白的降解程度。现阶段也有研究人员应用高效液相色谱法和FITC标记相结合来来测定体内或体外胶原蛋白的含量，直观反映胶原蛋白的分布及降解情况。

3.2.5 质谱分析

方法原理与步骤：质谱分析胶原蛋白主要包括高分辨质谱和低分辨质谱两种类型。利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪分析胶原蛋白降解后的肽段和分子量分布，间接反映胶原蛋白的降解程度；利用液相色谱-质谱联用技术测定胶原蛋白降解产物特征多肽的含量，间接反映胶原蛋白的含量，其高分辨率和高灵敏度有助于胶原蛋白降解产物的痕量分析，可参考YY/T 1805.3-2022 组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第3部分：基于特征多肽测定的胶原蛋白含量检测--液相色谱-质谱法测试。

3.2.6 凝胶电泳

方法原理与步骤：胶原蛋白能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按照重量比结合成复合物，使所带负电荷远远超过天然蛋白质本身原有电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按照分子量大小分离。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分析胶原蛋白降解后的分子量变化，从而判断降解程度。具体检测方法可参考YY/T 1805.2-2021 组织工程医疗器械产品　胶原蛋白　第2部分：Ⅰ型胶原蛋白分子量检测　十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定。

3.2.7 酶联免疫吸附测定（ELISA）

方法原理与步骤：ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，是一种特殊的酶免疫测定 (EIA) 类型，可使用抗体定量某种目标分子，抗体用于特异性检测分析物（例如肽、蛋白、抗体、小分子），酶直接或间接偶联该抗体，从而提供检测方法并可能扩增信号。采用特异性抗体，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法可进行胶原类型分析，可参考《中国人民共和国药典》（2020年版）四部3401测试。

3.2.8 原子力显微镜（AFM）

方法原理与步骤：原子力显微镜（AFM）成像通常用来观察干燥的或含水的胶原材料表面的纳米结构。可确定纤维类材料的微结构参数如孔隙率，纤维面积比例，纤维直径和纤维的周期性D带。周期性D带是沿纤维长轴以67nm为间隔的横纹，是胶原分子交错排列的特征。因为该测量要求AFM探针尖和表面相互接触，通常它的应用限于在二维平面上。从这些图像中常能测量到纤维的粗糙度和直径（高度），AFM也被用来观察和定量纤维周期性D带的差异。

3.2.9 圆二色（CD）光谱法

方法原理与步骤：胶原的CD谱图在195 nm附近的波长处有负峰，在221nm附近的波长处有正峰。如果检测不到在221nm附近的波长处有正峰，则提示没有三螺旋结构。如果定性检测证实供试品中有三螺旋结构，则可利用不同比例的系列胶原蛋白对照品和其完全变性的胶原蛋白对照品混合物作为外标法对照品，与在221nm附近的波长处的正峰强度进行拟合，实现三螺旋含量的相对定量分析。具体检测方法可参考YY/T 1849-2022 重组胶原蛋白 5.7.4 圆二色（CD）光谱。

3.2.10 微量差热分析（DSC）

方法原理与步骤：胶原蛋白的三螺旋结构的特征表现出特定的吸收峰，如组织提取牛I型胶原蛋白在（43±1）℃有吸收峰，如果检测不到特征峰则提示供试品中没有三螺旋结构。如果定性检测证实供试品中有三螺旋结构，则可利用不同比例的系列胶原蛋白对照品和其完全变性的胶原蛋白对照品混合物作为外标法对照品，对三螺旋含量进行相对定量分析。具体检测方法可参考YY/T 1849-2022 重组胶原蛋白 5.7.5 微量差热分析（DSC）。

胶原蛋白类植入医疗器械体外降解主要通过观察胶原蛋白物理外观形态变化、观察胶原蛋白三维螺旋结构变化、直接或间接测定胶原蛋白含量、降解液含量分析等进行表征。上述检测技术各有优劣势，通常会根据实验目的和实际条件，结合降解模型选择合适的技术组合，以全面评估胶原蛋白的降解过程[10,15]。定性检测可以直观反应胶原蛋白是否有存在降解，定量检测可以反应其降解程度。在实际监测过程中，定性定量检测手段会相结合使用。以酶降解中的胶原酶降解为例，可通过失重率检测、胶原蛋白浓度、羟脯氨酸的浓度以及圆二色（CD）光谱法来全面评估胶原蛋白降解的程度和速率、关注质量平衡。通过这些检测技术，可以更全面地表征胶原蛋白的体外降解，为医疗器械和生物材料的设计与开发提供科学依据。

4. 总结与展望

随着胶原蛋白在医疗器械方面的广泛应用，2021年4月15日，国家药品监督管理局发布《重组胶原蛋白类医疗产品分类界定原则》[16]明确规定重组胶原蛋白类产品的管理类别不低于Ⅱ类医疗器械。胶原蛋白作为无源植入物，及产品可部分或全部被人吸收或用于体内的止血海绵或医用敷料时按Ⅲ类医疗器械管理。这标志着对于市场层面重组胶原蛋白的创新和应用，政策层面已显示出更为积极的响应和规范举措，表明相关部门规范行业发展的决心，另一方面也体现了政策对创新产业发展的敏感度和支持力度[17]。胶原蛋白类植入医疗器械安全评价依赖于表征手段的进步与完善，且随着胶原蛋白基材料应用领域和植入部位多样化，以及胶原蛋白复合材料的创新应用，需要制定更加完善的胶原蛋白降解评价标准来实现对各种类型、各种应用产品的安全监管。

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