HLA-A2-GPC3 mTCR-T，优于GPC3CAR

靶向GPC3的HLA-A2限制性小鼠TCR-人T细胞，在小鼠中有效控制人肝细胞癌，优于GPC3 CAR-T细胞

Glypican-3(GPC3)是肝细胞癌(HCC) T细胞治疗的一个有前景的靶标。尽管针对GPC3的CAR-T细胞已显示出治疗效果，但其有效性受到诸如低持久性和表面GPC3脱落等挑战的限制。天然TCRs可能是一个替代选择，但在内源性库中鉴定GPC3特异性TCRs却很困难。这里，纳瓦拉大学研究团队，对HLA-A2转基因小鼠进行了表达人GPC3的腺病毒免疫，鉴定出一组能够识别GPC3(522-530)表位的TCR。克隆了3种小鼠GPC3-TCR（TCR-A、TCR-B和TCR-C），并改造了原代人T细胞（TCR-T）。TCR-T细胞有效识别GPC3+ HLA-A2+的人肝癌细胞，这种识别在GPC3沉默和HLA-A2阻断后减弱。TCR-B-T和TCR-C-T细胞显示出最高的反应性，其中TCR-B-T细胞表现出更优的效应功能、增殖能力和治疗效果，在异种移植HCC模型中尤为明显。值得注意的是，TCR-B-T细胞的表现优于第二代4-1BB GPC3特异性CAR-T细胞，这归因于较低的耗竭、增强的增殖、更强的效应功能和更好的韧性。此外，CAR-T细胞和TCR-B-T细胞的混合给药显著比同种细胞类型的间隔给药更有效，表明可能存在协同效应。转基因TCR与CAR联手，扩大了针对GPC3的受体库，用于HCC T细胞疗法。

癌胚抗原GPC3是一种细胞表面糖磷脂酰肌醇锚定蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族，对细胞生长、分化和迁移起重要作用。GPC3在HCC、肝母细胞瘤和其他肿瘤中高表达，但在非恶性成人组织中不表达，除了胎盘。最近，已经开发了针对GPC3的CAR，并且正在进行多项使用GPC3靶向CAR-T细胞治疗HCC患者的临床试验。早期试验数据显示，第二代GPC3-CAR的毒性可管理，但反应率不理想。除了已知的CAR-T细胞在实体瘤中的挑战外，GPC3的内在特性也阻碍了CAR-T细胞疗法的效果。类似于其他CAR靶向抗原，GPC3被脱落酶切割，并以可溶形式存在于肿瘤内和循环中。脱落的GPC3与表面结合的GPC3竞争CAR结合，加上表面GPC3的丢失，削弱了CAR-T细胞的有效性。

缺乏HLA呈递的抗原识别要求使得CAR在靶向表面TAAs方面优于转基因TCR。然而，TCR的结构和功能特性使其非常适用于ACT。因此，用TCR-T细胞比CAR-T细胞敏感得多，能够识别低至10-100倍的抗原。另一方面，CAR-T细胞通常比TCR-T细胞具有更强的效应功能，但在重复抗原暴露后往往会耗尽，导致扩增和生存能力受损。相比之下，TCR-T细胞在高抗原压力下表现出更大的扩增能力。重要的是，与CAR不同，TCR不受表面TAA脱落或可溶性TAA竞争的影响。这一优势促进了针对其他可脱落表面抗原的TCR的开发，如间皮素（NCT04809766）。因此，TCR的固有特性鼓励其用于GPC3靶向T细胞疗法的开发。

几项研究试图在HCC患者的内源性TCR库中或从体外刺激的健康供者外周血T细胞中鉴定GPC3特异性TCR，但这些努力收效甚微。胸腺髓质上皮细胞残余表达某些胚胎癌蛋白可能阻碍产生强大的GPC3特异性人T细胞反应。表达人MHC分子（HLA转基因小鼠）的小鼠为研究HLA相关免疫反应提供了有价值的模型。此外，人与小鼠之间蛋白序列和胸腺基因表达的差异使得这些小鼠能够对用作免疫原的人类TAA产生强烈的反应。HLA转基因小鼠已被广泛用于鉴定针对TAA（如gp100、p53、NY-ESO-1和MAGE-A3）的高亲和力小鼠TCR，并且用小鼠TCR改造的人T细胞在临床试验中已显示出安全性和有效性。

为了鉴定能够将人类T细胞重定向至GPC3+肿瘤的GPC3特异性TCRs，用编码人类GPC3的腺病毒（ADV-hGPC3）免疫了表达HLA-A*02:01和HLA-DRB1*01的HHD-DR1小鼠。从这些小鼠中，鉴定出一组针对HLA-A2限制性免疫优势表位GPC3(522-530)特异的TCRs。克隆了其中三种TCRs，使原代人T细胞能够识别GPC3+ HLA-A2+的人肝癌细胞，并在肝癌异种移植小鼠模型中控制肿瘤进展。重要的是，在这些ACT模型中，其中一种TCR表现出优于4-1BB GPC3-CAR的疗效。

HHD-DR1小鼠中发现GPC3特异性TCR

为了鉴定针对GPC3特异性TCR，从用ADV-hGPC3免疫的HHD-DR1小鼠中提取的脾细胞被用覆盖整个GPC3蛋白(580aa)的合成肽混合库刺激（每个肽段20aa并与相邻肽段重叠10aa，每8个肽段混合为1个Mix肽库，即共7个Mix肽库）。在CD8+细胞中检测到对混合肽库Mix7的特异性反应（图1B和C），该反应特异于包含自然加工、HLA-A2限制性CD8 T细胞表位[GPC3(522-530): FLAELAYDL]的肽GPC3(511-530)。接下来，用pGPC3(522-530)刺激免疫小鼠的脾细胞，并对产生高IFNγ的CD8 T细胞进行单细胞分选，随后用该肽进一步扩增（图1D）。鉴定了二十种不同的TCR克隆型并进行了表征（图1E）。最后，选择了3种TCR克隆型用于人T细胞测试（表S3）：克隆1H4和3E9（分别为TCR-A和TCR-B），它们通过趋同重组过程共享TCRβ链，以及克隆1F2/4B5（TCR-C）。

图1 在HHD-DR1小鼠中鉴定针对人GPC3的TCR

表S3 所选TCR的TCRα和TCRβ链序列

工程化的小鼠GPC3-TCR-人T细胞识别pGPC3(522-530)/HLA-A2复合物

原代人CD4和CD8 T细胞被用选定的TCR进行工程改造（图2A）。TCR（mTCRβ+）转导的CD8 T细胞与pGPC3(522-530)/HLA-A2 tetramer结合（图2B），并对pGPC3(522-530)脉冲T2细胞的刺激作出反应（图2C）。然而，只有表达TCR-A的CD4 T细胞能够与tetramer结合并识别肽脉冲的T2细胞，但其程度远低于CD8对应细胞。这些数据表明，GPC3-TCR对pGPC3(522-530)/HLA-A2复合物的识别在很大程度上依赖于CD8共受体。基于这些结果，后续研究主要使用了CD8 T细胞。

接下来，通过用逐渐降低浓度的tetramer染色TCR-T细胞来测量TCR结构亲和力。Tetramer结合的EC50显示，TCR-A具有最高的亲和力，其次是TCR-B，最后是TCR-C（图2D）。为了评估功能亲和力，将TCR-T细胞与用pGPC3(522-530)连续稀释浓度脉冲的T2细胞共培养，并通过测量表面CD137和细胞因子（IFNγ、IL-2和TNFα）的产生来评估反应。EC50值根据用于评估T细胞活化的参数而有所不同，但TCR的排名相对一致，其中TCR-A显示出最高的功能亲和力，其次是TCR-C和TCR-B（图2E）。

图2 评估GPC3特异性TCR的CD8依赖性、结构亲和力和功能性亲和力

GPC3-TCR-T细胞能够识别GPC3+HLA-A2+的人肝癌细胞，而 GPC3沉默和HLA-A2阻断会损害这种识别作用

为了研究GPC3-TCR-T细胞识别自然处理的GPC3的能力，选择了不同的肿瘤细胞系，包括肝细胞癌细胞系（图3A和表S5）。细胞根据其GPC3表达水平（通过RT-qPCR测量）进行排序，亲代SKHEP1细胞显示不可检测的水平（CT＞35）。关于HLA-A2的表达，HEPG2和SKHEP1自然表达了HLA-A*02:01等位基因（表S6），而其他5个肿瘤细胞系被遗传修饰以表达该等位基因（图3A，表S5和图S2）。HEP3B-A2和HuH7-A2细胞中转基因HLA-A2的低表达似乎是因为与抗原加工和呈递机制（APM）相关的基因表达受损（在HEP3B-A2和HuH7-A2中均存在）（表S7）以及较低的转导效率（HuH7）（图S2）。

接下来，将TCR-T细胞与这些肿瘤细胞系共培养。有趣的是，尽管对pGPC3(522-530)的功能亲和力最低，TCR-B-T细胞仍能识别所有测试的GPC3+ HLA-A2+肿瘤细胞，包括那些表达低水平HLA-A2（HEP3B-A2和HuH7-A2）或低水平GPC3（COS7-A2和A431-A2）的细胞（图3B）。TCR-B-T细胞对GPC3-TCRs共同识别的靶标也表现出更高的激活水平。没有TCR-T细胞识别GPC3- HLA-A2+细胞。有趣的是，虽然TCR-A和TCR-B不能识别HLA-A2阴性的细胞，但TCR-C显示出对PLCPRF5细胞的某些识别能力。当沉默GPC3表达时，TCR-T细胞的反应受损（图3C），这表明TCRs的GPC3特异性。通过阻断HLA-I和HLA-A2分子可以消除TCR-A和TCR-B识别靶细胞的能力（图3D）。然而，虽然HLA-I阻断消除了TCR-C对所有靶细胞的识别，HLA-A2阻断对TCR-C识别肿瘤细胞的影响不大（PLCPRF5细胞）或部分影响（HEPG2和PLCPRF5-A2）。

图3 TCR工程化的人CD8 T细胞识别GPC3+HLA-A2+肿瘤细胞

表S5 分析使用的肿瘤细胞系中的HLA-A2和GPC3表达

表S6使用的肿瘤细胞系的HLA I类基因型

图S2 报告基因、转基因HLA-A2和HLA-I分子的表达

表S7 使用的肿瘤细胞系中HLA I类基因和抗原呈递机制基因的表达水平

替代长度的肽段和肽/HLA复合物被GPC3-TCR识别

为了理解为什么TCR-B对GPC3+ HLA-A2+肿瘤细胞系的识别优于用最小GPC3(522-530)表位脉冲的HLA-A2+靶细胞，研究了包含FLAELAYDL核心的其他肽段。预测为HLA-A2的11mer FLAELAYDLDV和10mer RFLAELAYDL肽（表S9），与HLA-A2分子结合，其中11mer肽显示出最高的结合能力（图S4A）。有趣的是，TCR-B对11mer肽的识别与9mer pGPC3(522-530)相同或略好，但对10mer肽的反应性较低（图S4B）。相比之下，TCR-A和TCR-C对11mer肽的识别远不如9mer和10mer肽有效。这些数据表明，TCR-B可能识别一种不同的表位构象，这种构象在11mer肽中得以保留甚至更好地体现。此外，TCR-B对GPC3衍生的20mer肽FLAELAYDLDVDDAPGNSQQ（图S4C和D）也表现出一定的反应性，该肽最近在一名HLA-A*02:01+肝细胞癌患者的免疫肽组中被鉴定出来。

pGPC3(522-530)也被预测为HLA-C4的弱结合者（表S9），后者由在HEPG2和PLCPRF5细胞中表达的HLA-C*04:01等位基因编码（表S6）。为了测试TCR-C对pGPC3(522-530)/HLA-C4复合物的识别，生成了HLA-C*04:01+、TAP缺陷型细胞（721-C4-ICP47）（图S5A）。作为对照，也生成了HLA-A*02:01+的对应细胞（721-A2-ICP47）。有趣的是，pGPC3(522-530)也与HLA-C4结合（图S5B），并且TCR-C能够识别pGPC3(522-530)脉冲的721-C4-ICP47细胞，但TCR-A和TCR-B不能，尽管其效率低于肽脉冲的721-A2-ICP47细胞（图S5C）。这些数据表明，TCR-C对HEPG2和PLCPRF5衍生细胞的非HLA-A2限制性GPC3特异性识别（图3D）可能由HLA-C4呈递。

表S9 预测GPC3(522-530)(FLAELAYDL)核心表位与HLA-A2和HLA-C4分子的肽结合

图S4 被GPC3 TCR-B识别的替代GPC3肽

图S5 被GPC3 TCR-C识别的替代GPC3肽/HLA复合物

TCR-B-T细胞在响应GPC3+HLA-A2+肿瘤细胞时表现出更优的效应和增殖活性

在肿瘤细胞高密度下对效应功能的分析显示，TCR-B-和TCR-C-T细胞是最具反应性的淋巴细胞（图S6A-F）。TCR-B和TCR-C在识别靶细胞时诱导了最高的细胞因子产生，这通过ELISA和细胞内染色得到证实（图S6A-C）。CD107a膜暴露表明，TCR-B-T细胞具有最高的脱颗粒能力（图S6D），并且TCR-B-T细胞还能同时产生多种效应分子，特别是在对PLCPRF5-A2细胞的反应中（图S6E）。GzmB释放的ELISPOT分析与细胞因子分泌紧密匹配（图S6F）。此外，在高E:T比例（2.5-10）下，TCR-B-和TCR-C-T细胞显示出显著的细胞毒性活性（图S6G）。TCR-C-T细胞也对PLCPRF5细胞有反应，但效果不如对PLCPRF5-A2细胞的有效（图S6）。如预期的那样，HLA-A2和/或HLA-I阻断抑制了TCR-T细胞的效应功能。

为了更好地评估TCR-T细胞的效应特性，用逐渐降低的靶细胞浓度对其进行了挑战（图4）。TCR-B-T细胞表现出增强的反应性，表现为对HEPG2和PLCPRF5-A2细胞更高的CD137表达、IFNγ产生和细胞毒性活性，即使在低靶细胞密度或E:T比值下也是如此（图4A-C和图S7）。此外，TCR-B-T细胞在这些靶细胞的刺激下显示出更优的增殖能力（图4D）。TCR-C-T细胞在接受PLCPRF5细胞刺激后也能够增殖（图4D）。在所有情况下，HLA-I阻断都会抑制这种增殖。TCR-B改造的T细胞增强的功能性和增殖能力在6名不同供体中表现一致（图4E和图S7）。

图S6 GPC3 TCR-T细胞在识别GPC3+ HLA-A2+肿瘤细胞时的效应功能

图4 GPC3 TCR-T细胞在识别GPC3+ HLA-A2+肿瘤细胞时的效应功能和增殖能力

图S7 来自多个供体的GPC3 TCR-T细胞在识别GPC3+ HLA-A2+肿瘤细胞时的效应功能

TCR-B-T细胞在过继细胞转移(ACT)治疗中有效控制肿瘤进展

为了评估GPC3-TCR的治疗效果，PLCPRF5-A2荷瘤NSG小鼠接受了TCR-B、TCR-C或UTD T细胞与IL-2的治疗（图5A）。有趣的是，TCR-B T细胞治愈了所有接受治疗的小鼠，而TCR-C T细胞仅轻微延缓了肿瘤生长和死亡（图5B和图S9A）。TCR-B T细胞在携带HEPG2肿瘤的小鼠中也表现出优越的治疗活性（图5C和图S9B）。此外，TCR-B T细胞的疗效与肿瘤荷载小鼠的性别无关（图S9A和C）。

图5 TCR-B-T细胞在ACT环境中有效控制了肿瘤进展

图S9 TCR-B-T 细胞在ACT治疗中有效控制了肿瘤进展，这种疗效依赖于系统性的IL-2支持

TCR-B-T细胞表现出增强的植入能力和在ACT后产生强烈反应的能力

为了探究导致TCR-B-和TCR-C-T细胞在ACT中行为差异的因素，分析了血液和肿瘤中转移细胞的命运（图6A）。循环中人CD8 T细胞中mTCRβ+细胞的比例随时间下降（图6B）。然而，从转移后第2天到第9天，循环mTCRβ+细胞的总数显著增加，其中TCR-B-T细胞组的扩增尤为明显（图6C）。这种扩增还与循环人CD8 T细胞总数的增加相关，这一显著增长仅在TCR-B组中观察到。

到第10天，检查了肿瘤中浸润的人CD8 T细胞（TILs）。与UTD组和TCR-C组相比，TCR-B组中人CD8 TILs的比例分别高约60倍和15倍（图6D）。此外，TCR-B组内人CD8 TILs中的mTCRβ+细胞比例相较于输注细胞产品增加了50%，而TCR-C组增加了20%（图6E）。这些发现表明，TCR-B-T细胞在接受ACT后比TCR-C-T细胞具有更好的植入能力。

IL-2的支持对于TCR-B-T细胞的抗肿瘤效果至关重要（图S9D）。在缺乏IL-2的情况下，TCR-B组中的人CD8 TILs的比例仍高于UTD组（图S9E），尽管人CD8 TILs中mTCRβ+细胞的比例低于输入水平（图S9F），这表明没有IL-2支持时，TCR-T细胞的扩增不足。

重要的是，TCR-B-TILs表现出比其TCR-C对照组更高的GzmB和Ki-67水平（图6F），表明在肿瘤内的溶细胞和增殖能力增强。在与激活（CD137）、耗竭（PD-1和LAG-3）以及终末分化（KLRG1）相关的标记物中未观察到显著差异（图S9G）。TCR-B-T细胞在识别肿瘤后增殖能力的增加可能支持它们转移后的定植。这与其更强的效应功能一起，可能解释了它们更优的抗肿瘤效果。

图6 TCR-B-T细胞表现出增强的植入能力和在ACT后产生强烈反应的能力

TCR-B-T细胞在ACT治疗中优于CAR-T细胞

为了直接比较TCR-B-T细胞与临床上相关的GPC3特异性CAR（基于YP7杂交瘤并结合第二代4-1BB共刺激结构域，如NCT05003895），用GPC3-CAR和TCR-B转导了人CD8 T细胞。两种转导均高效（图S10A），随后将这些修饰后的细胞分离并扩增，以详细比较它们的抗肿瘤特性（图7A）。

在初步测试中，GPC3-CAR-T细胞和TCR-B-T细胞分别暴露于表达高水平和中等水平表面GPC3的HEPG2和PLCPRF5-A2细胞（图7B）。GPC3-CAR-T细胞对HEPG2细胞的识别优于对PLCPRF5-A2细胞的识别（图7C）。尽管差异不明显，在高T:E比例下，CAR-T细胞对HEPG2细胞的识别略好于TCR-B-T细胞，而在低比例下，TCR-B-T细胞对PLCPRF5-A2的识别更好。因此，使用HEPG2细胞系来比较这两种T细胞类型。在早期培养阶段，CAR-T细胞最初裂解HEPG2细胞的速度更快，在6-7h内达到90%的裂解率。TCR-B-T细胞则需要11-12h才能达到类似的水平，但维持了更高的肿瘤细胞裂解率，最终在16h时达到了100%的细胞毒性（图7D）。

为了评估在反复肿瘤暴露下的性能，进行了一项重复抗原挑战试验（图S10B），同时包括了TCR-C-T细胞作为对比。在多次挑战中，TCR-B-T细胞始终表现出更优的肿瘤控制能力和强大的扩增能力，尽管后期T细胞死亡率略有增加（图S10C-D）。GPC3-CAR-T细胞最初对肿瘤细胞有良好的控制效果，但早期就出现了显著的细胞死亡，限制了其长期扩增，而TCR-C-T细胞虽然存活，但并未扩增。CD137表达水平表明TCR-B-T和GPC3-CAR-T细胞均得到有效激活，尽管CAR-T细胞在各次挑战中持续显示出更高水平的抑制标志物（图S10E）。相比之下，TCR-C-T细胞显示出较少的激活和耗竭，表明与肿瘤靶点的相互作用有限。

在ACT实验中，CAR-T细胞最初在前6天内对肿瘤生长的控制略优于TCR-B-T细胞。然而，随着时间的推移，CAR-T细胞的效果逐渐减弱，而TCR-B-T细胞则继续提供更优的长期肿瘤控制（图7E）。使用YP7杂交瘤衍生的CAR-T细胞的研究结果与HEPG2异种移植模型中已发表的数据一致。

图7 TCR-B-T细胞在ACT治疗中表现优于基于YP7的CAR-T细胞

图S10 重复的肿瘤挑战实验揭示了针对GPC3的TCR-T细胞和CAR-T细胞在细胞毒性、扩增和激活/耗竭方面的差异

TCR-B-T细胞表现出较低的耗竭水平、优越的增殖和效应能力，以及在转移后比CAR-T细胞更长的持久性

随后，检查了血液和肿瘤中转移的T细胞。循环人CD8 T细胞的总数在转移后第2天到第6天显著增加，GPC3-CAR组观察到更明显的上升（图8A）。然而，到第12天时，TCR-B组的血液人CD8 T细胞水平保持稳定，而GPC3-CAR组则下降。第13天对TILs的分析显示，与GPC3-CAR组相比，TCR-B-T细胞治疗组中的人CD8 TILs比例更高（图8B）。此外，TCR-B-TILs相较于GPC3-CAR-TILs表现出更高的GzmB和Ki-67表达，但PD-1的表达水平为中等（图8C-E）。存活肿瘤细胞表面的GPC3和HLA-A2表达水平分别在GPC3-CAR组和TCR-B组中降低，表明转移的T细胞引发了癌症免疫编辑（图8F）。值得注意的是，在ACT后第102天，TCR-B-T细胞在治愈小鼠的骨髓中仍可检测到（图S12）。较低的耗竭状态，加上持续的增殖和效应功能，可能是TCR-B-T细胞在ACT中表现优于GPC3-CAR-T细胞的原因。

GPC3-CAR-T和TCR-T细胞的不同免疫编辑效应支持采用联合策略来应对每种疗法独特的肿瘤逃逸机制。为了测试这一点，携带HEPG2肿瘤的NSG小鼠首先接受了CAR-T或TCR-T细胞的半剂量治疗，12天后分别接受第二次TCR-T或CAR-T细胞治疗。对照组则单独接受两次CAR-T或TCR-T细胞治疗。如图S13所示，CAR-T和TCR-T细胞的错峰给药显著延长了中位生存期，相较于单次高剂量给药（图7E）。异源给药比同源给药明显更有效，表明联合策略有效地减轻了每种独立治疗中观察到的肿瘤逃逸现象。

图8 与CAR-T细胞相比TCR-B-T细胞在转移后表现出较低的耗竭水平和更强的反应

图S12 在长期存活的小鼠骨髓中检测到TCR-B T细胞

图S13 CAR-T细胞和TCR-T细胞的联合给药比单一疗法更有效

总结

在天然TCR库中识别新抗原特异性TCR是可行的，但识别TAA特异性TCR更具挑战性，因为中心耐受机制会减少对自身抗原反应的T细胞克隆。为了克服对GPC3的耐受性，已采用异体反应方法来激活高亲和力的GPC3特异性T细胞。然而，通过异体反应生成的TCR存在限制其临床应用的风险。在这里，利用了人类GPC3在HLA转基因小鼠中的强免疫原性，识别出一种针对GPC3(522-530)表位的HLA-A2限制性小鼠TCR，在临床前肝细胞癌模型中显示出强大的治疗效果。这是首次使用非异体反应方法识别出具有治疗潜力的GPC3特异性TCR。先前的研究已经证明了在HLA转基因小鼠模型中生成的TAA特异性TCR的安全性和临床前景。尽管可能有人担心这些TCR在人体受者中潜在的免疫原性，但实际上这并不是一个重要的限制因素。

这里克隆的三个GPC3-TCR识别了GPC3+HLA-A2+肿瘤细胞，并且这种识别在GPC3沉默后被破坏，突显了它们的抗原特异性。TCR对pGPC3(522-530)负载的靶标细胞的亲和力与对GPC3+HLA-A2+肿瘤细胞的亲和力并不一致。值得注意的是，TCR-B对9mer脉冲靶标细胞显示最低的功能亲和力，却是对GPC3+HLA-A2+肿瘤细胞反应最强烈的。这种差异可能是由于天然呈递的肽不同于pGPC3(522-530)。实际上，10mer肽RFLAELAYDL和11mer肽FLAELAYDLDV也与HLA-A2结合，其中11mer肽表现出最强的结合。有趣的是，TCR-B是唯一一个能够以相同或略优于9mer肽的方式识别11mer肽的TCR。该TCR还识别到了20mer肽FLAELAYDLDVDDAPGNSQQ，这一肽段是在HCC HLA-A*02:01患者的肝细胞免疫肽组中通过无偏倚质谱分析发现的。超过11个残基的肽在HLA-I免疫肽组中较为罕见，主要来源于膜蛋白和分泌蛋白。这些蛋白质被运输到内质网（ER），并由ER和转高尔基体网络蛋白酶处理，当与AMP脱耦时，经常生成具有羧基末端延伸的更长的HLA-I配体。作为分泌蛋白，GPC3可能同样产生延长的C端表位。免疫肽组学研究可以阐明天然呈现的含FLAELAYDL的肽是否包括更长的序列。

虽然TCR通常局限于特定长度的肽段，但有些TCR，如TCR-B，可以识别不同长度的肽段。较长的肽段在MHC-I槽中中部膨胀，并表现出显著的移动性，但在与相应的TCR结合时可以变平，这导致了与传统9mer配体观察到的MHC-I接触足迹相似的结果。TCR与肽/MHC-I复合物结合时CDR的灵活性和TCR诱导的肽段形状变化可能解释了TCR-B识别不同长度肽段的能力。需要进一步研究来理解TCR-B对GPC3+HLA-A2+肿瘤细胞的高度亲和力。

虽然TCR-A和TCR-B严格依赖于HLA-A2，但TCR-C在HLA-A2和其他HLA-I背景下均能识别GPC3。具体来说，发现pGPC3(522-530)也能与HLA-C4结合，这种情况对于能够结合多种HLA分子的肽来说并不罕见。有趣的是，TCR-C能够识别pGPC3(522-530)/HLA-C4复合物。尽管这一现象较为罕见，但并非没有先例，可能源于TCR更倾向于结合肽而不是完整的肽-MHC复合物。这一特性或许可以解释TCR-C对pGPC3(522-530)/HLA-A2 tetramer的低亲和力，这需要更强的TCR-肽-MHC相互作用才能实现稳定结合。存在于HEPG2和PLCPRF5细胞中的HLA-C*04:01等位基因支持TCR-C对这些细胞的非HLA-A2限制性识别。该等位基因也存在于SKHEP1-和HEP3B-衍生的细胞中。SKHEP1-GPint和HEP3B细胞中GPC3和HLA-I分子的低表达水平，可能解释了TCR-C在这两种细胞系中无论是在HLA-A2还是HLA-C4背景下均无反应性的原因。

在三个克隆的TCR中，TCR-B和TCR-C对GPC3+HLA-A2+肿瘤细胞表现出最高的反应性，其中TCR-B赋予了TCR-T细胞在异种移植HCC模型中更优的效应功能、增殖能力和治疗效果。这种增强的效果体现在ACT后血液和肿瘤中TCR-B-T细胞的水平更高。肿瘤浸润的TCR-B-T细胞还显示出比TCR-C更高的Ki-67和GzmB水平，表明其在体内的增殖和抗肿瘤活性更强。这些发现使TCR-B成为针对HCC的GPC3靶向TCR疗法的一个有前景的候选者。

TCR-B-T细胞的治疗效果高度依赖于外源性IL-2的支持。γc细胞因子在ACT后T细胞植入中起着关键作用，而ACT前的淋巴耗竭通过移除细胞因子"吸收池"来增强转移细胞的扩增。尽管NSG小鼠缺乏内源性T细胞，使γc细胞因子可被转移细胞利用，但人T细胞无法识别小鼠的γc细胞因子，特别是IL-2和IL-15。然而，不能排除这些细胞在初次转移时也需要额外的IL-2支持以实现初始扩增的可能性。与此一致的是，在采用TILs的ACT临床试验中，以及TCR-T细胞的临床试验中，通常会在治疗后的前3-4天内给予几剂IL-2，以促进T细胞的扩增。最近的研究强调了工程化CD4 T细胞在ACT中的双重角色，作为效应细胞和辅助细胞，通过分泌IL-2和支持DC激活来促进CD8 T细胞的扩增。结合TCR工程化的CD4和CD8 T细胞可以减少对外源性IL-2的需求。然而，已鉴定的HLA-I限制性TCRs依赖于CD8共受体，这将其限制在CD8 T细胞中。共同工程化这些TCRs与CD8共受体可以使它们在CD4 T细胞中发挥作用，可能改善治疗效果。

证明了TCR-B-T细胞在HCC的临床前模型中优于YP7杂交瘤衍生的第二代4-1BB GPC3-CAR-T细胞。CAR的固有特性可能是GPC3-CAR-T细胞表现较差的原因。事实上，在重复抗原挑战试验中，GPC3-CAR-T细胞早期表现出有效性，但在连续挑战下迅速死亡并增加了抑制性标志物的表达，这可能导致其体内功能减弱和扩增受限。相比之下，TCR-B-T细胞在多次挑战中保持了优越的肿瘤控制、强大的扩增能力和适度的抑制性受体表达，支持其在过继细胞治疗（ACT）设置中的持久增殖能力和持续效应功能。此外，检测到治愈小鼠在接受转移后102天内骨髓中仍有TCR-B-T细胞存在，表明这些细胞存活得足够长，可以分化为长期记忆T细胞。总之，TCRs为HCC的T细胞治疗提供了有价值的GPC3靶向选择。

尽管这些结果令人鼓舞，但用TCR靶向GPC3可能存在几个局限性。HLA限制是一个主要挑战。本研究中鉴定的TCR针对HLA-A*02:01等位基因，为了使GPC3-TCR疗法惠及更多患者，需要开发针对其他HLA等位基因的额外TCR。此外，并非所有靶向GPC3的TCR都优于CAR：在ACT中测试的两种GPC3-TCR中，只有TCR-B在与GPC3-CAR的竞争中表现出色。为了在ACT中有效，TCR必须对天然处理的表位表现出最佳亲和力，并保持强大的T细胞效应功能、增殖能力和韧性。

TCR-T和CAR-T疗法都面临着内在的肿瘤抵抗机制，如抗原丢失影响CARs，以及HLA丢失或APM突变影响TCRs。这里数据揭示了GPC3-CAR-T和TCR-B-T细胞的不同免疫编辑：CAR-T倾向于选择GPC3表达减少的肿瘤细胞，而TCR-B-T则倾向于选择HLA-A2表达较低的细胞。值得注意的是，混合给药比单次或间隔给药更有效，这表明联合使用CAR-T和TCR-T可能更好地对抗每种疗法特定的肿瘤逃逸机制。

最后，重复的抗原挑战实验显示，尽管TCR-B-T细胞表现出更优的肿瘤控制能力、强大的扩增能力和增强的韧性，但在连续的肿瘤暴露后，它们仍然容易表达抑制性受体并发生细胞死亡。这种T细胞随时间逐渐下降的情况限制了T细胞疗法的长期效果。分阶段给予T细胞可以减轻这一影响，正如与单次高剂量给药相比，分阶段给予CAR-T和TCR-T细胞所观察到的改善结果所示。

参考文献：

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