2024 SITC，TCR-T细胞疗法最新内容精选(上)

癌症免疫治疗学会（SITC）第39届年会于2024年11月6日-10日在美国休斯顿召开。SITC年会是世界上最大的专注于癌症免疫治疗的国际盛会，SITC的愿景是通过促进科学交流与合作教育计划，旨在让癌症患者被"治愈"在某一天能够成为现实。这里整理了在2024 SITC中关于TCR-T细胞疗法的一些更新，分为【上中下】三篇，欢迎在评论区继续补充！

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TCR工程化自体PRAME靶向T细胞疗法与编码PRAME的mRNA联合用于实体瘤治疗

Immatics；Moderna, Inc.；MD安德森癌症中心；哈佛医学院Dana-Farber癌症研究所；纪念斯隆-凯特琳癌症中心

背景：过继性T细胞疗法（ACT）是治疗实体瘤的有前景的抗癌方法，但在实现完全缓解方面仍面临挑战。ACTengine IMA203是一种针对HLA-A*02:01阳性晚期或复发性癌症患者的实验性ACT，用于治疗实体瘤。IMA203产品由经过基因修饰的患者T细胞组成，这些T细胞表达一种重组TCR，靶向癌细胞上HLA-A*02:01限制的PRAME表位。在一项正在进行的1期试验中，IMA203显示出良好的安全性，并在黑色素瘤患者中确认的ORR为55%。为了进一步提高其临床疗效，IMA203将与封装了编码IMA203 PRAME衍生靶标肽的mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）联合使用。在此介绍支持这种ACT-mRNA组合的临床前概念验证数据，并介绍首次人体（FIH）1期临床联合研究的设计。

方法：人单核细胞衍生的树突状细胞（moDCs）被转染了不同剂量的LNP包裹的mRNA构建体，并与IMA203 T细胞共培养长达96h。通过流式细胞术定量检测T细胞表面活化标志物CD25、CD69和CD137的表达。IFNγ分泌在转染后24h通过ELISA测定。细胞增殖通过在不同时间点绝对量化细胞数量来监测。未转导的T细胞和模拟转染的moDCs作为阴性对照。

结果：与不同mRNA-LNP转染的moDCs共培养后，IMA203 T细胞上调了所有评估的活化标志物的表达，并以mRNA-LNP剂量依赖的方式增加了IFN-γ的浓度。同时，IMA203 T细胞增殖，导致CD8+ IMA203 T细胞数量增加。相反，这些效应在阴性对照组中未观察到，从而证实了反应的抗原、TCR和剂量依赖性。根据结果，选择了一种lead mRNA构建体，推进至FIH试验。

结论：这里已经建立了临床前的概念验证，并证明含有编码PRAME的mRNA的LNPs可以强烈激活IMA203 T细胞并诱导其增殖。计划进行一项IMA203与选定的mRNA-LNP构建体联合使用的FIH临床研究。在FIH一期试验中，将在多达15名患有晚期或复发性皮肤黑色素瘤和滑膜肉瘤的患者中评估联合疗法的安全性、耐受性和有效性。

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开发一个靶标不可知平台，评估TCR-T疗法对人原代组织的反应性

TScan Therapeutics

背景：识别靶点的能力对于TCR-T疗法至关重要，因为能够识别在关键器官中高表达的off-targets的TCRs可能会导致毒性。TCR-T疗法需要一个完全的人类系统来适当降低其在临床研究中的风险。由于缺乏相关的动物模型来检测TCRs的潜在off-targets活性，因此依赖于由位置扫描突变指导的预测计算算法。这些方法无法筛选出与目标表位序列同源性低的潜在off-targets。为了解决这些限制，TScan开发了SafetyScan--一种无偏见、全基因组、高通量的平台，用于消除与主要人体组织交叉反应的TCR候选物。

方法：表达候选TCR的T细胞与表达全基因组蛋白片段库的靶细胞共同培养。被TCR识别的靶细胞进行测序，以揭示TCR的天然靶点以及潜在的off-targets，即使这些off-targets与目标表位的序列同源性较低。为了确定这些潜在的off-targets是否是TCR的真实脱靶位点，表达候选TCR的T细胞与来自重要和非重要器官的上皮、间充质、内皮、成纤维和肌肉细胞（包括男性和女性供体来源的原代和诱导多能干细胞衍生的细胞）共同培养，这些细胞内源性地表达相应的HLA和潜在的off-targets。培养上清液中的IFN-γ水平用作T细胞反应性的指标。批量RNA-seq量化原代细胞中潜在脱靶位点和HLA的表达。

结果：在一项能力证明研究中，评估了一种来自不同赞助商的亲和力增强型TCR，该TCR由于与心肌蛋白titin的脱靶反应导致了临床毒性。全基因组筛选确定了多个潜在的off-targets，包括titin。表达亲和力增强型TCR的T细胞与iPSC衍生的心肌细胞共培养显示出了显著的反应性。RNA-seq证实这些细胞中表达了titin，尽管其表达水平低于预期的心脏组织。该平台被应用于评估和降低TScan的ImmunoBank中当前正在临床研究的6种TCR的潜在脱靶风险，这些TCR限制于HLA-A*02:01、HLA-A*01:01、HLA-B*07:02和HLA-C*07:02，并针对HPV16 E7、PRAME、MAGE-A1和MAGE-C2。

结论：这些数据展示了全面的全基因组筛选在识别潜在脱靶效应和使用RNA-seq对原代人细胞panel进行表征方面的敏感性，有助于选择合适且生理相关的原代人细胞来测试脱靶反应。

359

T-Plex的临床前模型，一种针对肿瘤内抗原和HLA异质性的定制多靶点TCR-T细胞疗法

TScan Therapeutics

背景：肿瘤内抗原异质性是靶向癌症治疗的主要挑战，包括TCR-T过继治疗。并不是肿瘤中的每个细胞都表达特定的肿瘤相关抗原，缺乏靶向蛋白的肿瘤细胞最终会导致复发。此外，HLA位点的杂合性丢失可以使细胞对依赖于受影响HLA的TCR-T疗法产生抗性。为应对这些挑战，TScan正在构建一个识别不同靶抗原并呈现在多种HLA等位基因上的治疗性TCR的免疫库。选择2-3种针对患者相关抗原和完整HLA的TCR，以构建定制的T-Plex 产品，解决靶点和HLA多样性的问题。

方法：TScan日益壮大的ImmunoBank目前包含6种针对来自肿瘤相关抗原 MAGE-A1、MAGE-C2、PRAME和HPV16 E7的表位特异性TCR，并且可以靶向多种HLA，包括 HLA-A*02:01、HLA-A*01:01、HLA-B*07:02 和 HLA-C*07:02。为了展示T-Plex的优势，进行了体外和体内临床前研究，其中混合了多种癌细胞系作为异质性实体瘤的模型。评估了TCR-T单药治疗或多重治疗的疗效，以测试T-Plex产品中的两种治疗性TCR是否表现出相加或协同作用。评估了多种T-Plex产品的场景，包括针对两种不同HLA上的同一抗原、共享HLA上的两种抗原或两种不同HLA上呈现的两种抗原。

结果：单药TCR-T疗法仅针对表达靶向肽/HLA的癌细胞亚群，而T-Plex产品通过靶向所有与T-Plex相关的肽/HLA组合的肿瘤细胞，表现出更广泛的细胞毒性活性。虽然每个单独的TCR-T组分都能选择性地杀死其靶向的癌细胞亚群，但两种T-Plex组分之间的信号传导也表现出相互作用。在T-Plex中，一个TCR-T组分对靶标的活性增强了另一个TCR-T组分对肿瘤的功能。这一现象主要是由细胞因子介导的，包括第二个TCR-T组分的靶标非依赖性扩增及其靶标依赖性结合的增强。

结论：T-Plex 被设计用于模拟对癌症的天然多克隆T细胞反应，并已在临床前模型中显示出其能够应对肿瘤内异质性，表现出加性和协同活性。随着TScan的免疫库不断扩大，定制的T-Plex产品可以针对更多患者的独特肿瘤进行个性化调整。

375

发现了一种针对实体瘤多模式治疗的MAGE-A4特异性TCR-T疗法候选者

TScan Therapeutics

背景：虽然TCR-T疗法已经改变了癌症免疫治疗的格局，但其疗效和持久性常常受到肿瘤异质性、抗原逃逸和杂合性丢失的限制。使用针对不同抗原并限制于几种HLA的多种TCR-T治疗实体瘤是一种有前景的策略，可以克服癌症免疫逃逸，并可能提高TCR-T疗法的疗效。MAGE-A4在多种恶性肿瘤中表达，包括非小细胞肺癌、结肠癌和黑色素瘤，而在健康组织中仅限于免疫豁免部位表达。MAGE-A4的表达还与多种适应症的不良预后相关。结合TScan当前临床管线中的TCR-T候选药物，开发MAGE-A4特异性TCR-T预计将进一步推动多靶点TCR-T治疗患者的进展。

方法：利用TScan的ReceptorScan平台，发现了针对两个A*02:01限制的MAGE-A4衍生表位的TCR。高通量筛选试验ActivScan用于从MAGE-A4特异性克隆型库中选择高表达和功能性的TCR，并使用表达不同水平MAGE-A4的癌细胞系全面检查了这些TCR的细胞毒性功能。通过检测对110种I类等位基因的反应性来评估异体反应性，并使用专有的SafetyScan平台评估主要TCR的脱靶反应性，以确定TCR肽特异性。此外，通过将工程化T细胞与正常原代人细胞共培养进一步确认了安全性。最后，通过将工程化T细胞转移到植入MAGE-A4表达异种移植物的小鼠体内评估了TCR的有效性。

结果：ReceptorScan 通过筛选来自10名健康供者的幼稚CD8+ T细胞，识别出2100多个针对两个MAGE-A4表位的TCR。使用ActivScan平台选择了高亲和力和高功能的MAGE-A4特异性TCR。多种TCR在细胞毒性试验中表现出效力和活性，并且在抗原刺激下能够释放细胞因子并增殖。安全性评估显示，主要TCR具有靶向肽特异性，对测试的110种等位基因或正常原代人细胞均未观察到异体反应性。MAGE-A4特异性TCR-T细胞在异种移植小鼠模型中也表现出体内减少肿瘤负荷的疗效。

结论：自体MAGE-A4特异性TCR-T治疗候选药物TSC-202-A0201已推进至IND支持性研究，以加入TScan的TCR免疫库，最终目标是作为最佳的免疫治疗策略之一，用于治疗实体瘤患者，该策略被称为T-Plex多靶点复用方法。

157

高通量同时鉴定驱动突变的公共新抗原及其相应的功能性TCR

MD安德森癌症中心

背景：反复出现的非同义、功能获得性致癌基因突变可以产生公共新抗原。识别公共新抗原非常有意义，因为它们是理想的免疫治疗靶点。要产生新抗原，含有突变的肽必须与HLA分子结合，并在细胞表面呈现。此外，T细胞库中必须存在能够被该特定肽-HLA复合物激活的T细胞。尽管单个氨基酸突变可以产生38种独特的8-11mer肽，但大多数不会被特定的HLA呈现。

方法：为了全面识别由驱动突变产生的新抗原，开发了一种高通量方法，将串联mini基因驱动的T细胞扩增与单细胞DNA-barcoded肽:HLA tetramer测序相结合。串联mini基因被设计为编码29种最常见的癌症驱动突变中所有可能的8-11mer长度的突变跨越肽。串联mini基因mRNA被转染到单核细胞衍生的DC细胞中，然后与自体CD8 T细胞共培养。因此，在单次培养中，所有由该个体HLA呈递的新抗原衍生肽都有机会刺激T细胞。为了鉴定由此产生的免疫反应，合成了所有可能的8-11mer肽，并使用UV介导的配体交换ELISA测试其HLA结合能力。总共测试了每个HLA的1165个肽，这些肽覆盖了29种驱动突变，包括HLA-A*01:01、HLA-A*02:01和HLA-B*07:02。构建了一个包含所有结合肽的DNA-barcoded肽:HLA tetramer库，并使用单细胞工作流程对细胞进行染色和测序。测序后，确定了克隆扩增的T细胞的配对TCRαβ序列及其抗原特异性（通过tetramer相关DNA-barcoded）。

结果：观察到针对先前确定的驱动突变新抗原（包括FLT3:D835Y、IDH2:R140Q、DNMT3A:R882H等）的扩增多克隆T细胞反应，并且还鉴定出针对未见报道的新抗原（包括FLT3:D835V、DNMT3A:R882H、DNMT3A:R882C、PTPN11:D61Y等）的T细胞反应，表明这些肽-HLA复合物被呈递并能够引发免疫反应。表达新TCR的工程化TCR-T细胞通过荧光tetramer染色与"正确"的新抗原结合，并在与肽脉冲B-LCL共培养时表现出剂量依赖性的T细胞激活。进一步确认所鉴定的抗原是真正的癌症新抗原，因为观察到TCR-T细胞对天然携带IDH2:R140Q、DNMT3A:R882H或DNMT3A:R882C突变的癌细胞具有抗原特异性反应和细胞毒性。

结论：总之，这里开发了一种灵敏、高通量的"一锅法"方法，能够确认驱动突变的免疫原性，并同时获取其相应的TCR序列，具有灵活性以插入新的mini基因，扩大对抗原的兴趣筛选。

403

当一个CD4TCR与一个CD8TCR结合时，CD4+T细胞、CD8+T细胞、基质细胞和肿瘤细胞之间的四细胞相互作用作为潜在的癌症根除机制

芝加哥大学；日本癌症研究基金会

背景：即使肿瘤被T细胞浸润，进行性生长最终仍会导致宿主死亡。使用ICI或TILs的过继转移已带来先进的免疫疗法，这些疗法在某些类型的癌症患者中可以取得成功。尽管这些免疫疗法已经革新了现代癌症治疗，但实现肿瘤根除仍然是一个主要挑战。当ICI和TIL疗法有效时，癌症特异性新抗原似乎是重要的免疫靶标。另一种方法是从新抗原特异性T细胞中分离TCRs，用于过继转移TCR-T细胞疗法。希望确定TCR-T细胞疗法根除已建立的实体瘤所需的要求。

方法：使用了UV诱导的、原发性和内源性的癌细胞系6132A及其已深入研究的新抗原mL9。从针对mL9特异性的CD4+T细胞中分离出一个TCR（CD4TCR），并从6132A特异性的CD8+T细胞中分离出另一个TCR（CD8TCR），这些细胞是从对6132A免疫的小鼠脾脏中生成的。将CD4TCR和CD8TCR克隆到逆转录病毒载体中，并评估了体内和体外TCR工程化CD4+和CD8+ T细胞的反应。

结果：CD4TCR识别了免疫抑制性的肿瘤基质，并导致其破坏，随后使由MHC II阴性的6132A癌细胞形成的肿瘤长期生长停滞。然而，CD4TCR未能完全根除肿瘤。值得注意的是，单独使用的CD8TCR无效，但当CD8TCR与CD4TCR联合使用时，未被操纵的大实体瘤被根除了。因此，有效的治疗需要CD8TCR直接识别癌细胞以及CD4TCR识别基质。作为潜在机制，体外分析表明，CD4+和CD8+ T细胞与基质APC和癌细胞之间存在四种细胞类型的相互作用，从而有效消除癌细胞。

结论：CD8 TCRs仅在与CD4 TCR联合使用时，才能清除表达未操纵突变新抗原的长期存在的实体瘤。体外实验表明，四细胞相互作用对于癌细胞的清除至关重要。

358

针对EGFR突变NSCLC的TCR工程

MD安德森癌症中心；莱斯大学

背景：表皮生长因子受体（EGFR）在30%的转移性NSCLC中发生突变。酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）已被开发用于针对EGFR的关键突变，从而提高生存率。尽管取得了这一成功，但耐药性最终仍会发生。因此，需要替代的治疗策略来克服这种耐药性并提供持久的反应。细胞疗法已取得令人印象深刻的持久临床反应。在细胞疗法中，TCR工程可以实现对特定肿瘤抗原的集中靶向。在这里，评估了EGFR突变的免疫原性，并研究了使用TCR工程靶向这些突变的可行性。

方法：专注于EGFR的常见L858R、T790M和C797S突变，并预测了与美国人群中10种最常见HLA具有高亲和力的新抗原。合成了肽段并将其脉冲加载到DC细胞上，以刺激健康供体和肺癌患者的血液。通过tetramer分选分离出抗原特异性T细胞群体，经过快速扩增后，暴露于内源性表达突变EGFR的癌细胞中，以确保免疫表位自然加工和呈递。反应性T细胞随后进行了单细胞TCR/RNA测序，以鉴定完整的αβTCR序列。通过逆转录病毒载体将TCR合成并转导到HLA匹配的PBMCs中。通过ELISpot和Cr-51释放法评估抗原特异性T细胞的活化和细胞毒性。进行了肽剂量反应实验，以确定TCR的特异性和敏感性。

结果：来自L858R、T790M和C797S突变的表位分别通过抗原特异性T细胞刺激和tetramer染色在HLA-A*03:01、HLA-A*02:01和HLA-A*02:01上被确认具有免疫原性。抗原特异性T细胞以20:1效应细胞：靶细胞的比例裂解表达内源性EGFR突变的H1975细胞，证实这些抗原确实是内源性处理并呈递的（【L858R：肽脉冲 97%；内源性 26%；亲本 0%】 / 【T790M：肽脉冲 48%；内源性 15%；亲本 3%】/ p<0.0001）。TCRs成功表达在健康供者PBMCs中，纯化并扩增用于功能评估。工程化的TCR-T细胞能够分泌IFN-γ，通过ELISpot检测到（37个斑点 vs. 0.33个斑点，p=0.0019）。TCR-T细胞还表现出对HLA匹配细胞系的细胞毒性作用，通过Cr-51释放实验在20:1效应细胞：靶细胞比例下显示（【L858R：63% vs. 23%，p<0.0001】/【T790M：40% vs. 8%，p<0.0001】/【C797S：24% vs. 11%，p<0.001】）。肽剂量反应表明TCR-T细胞具有特异性和敏感性。

结论：研究证实了EGFR突变的免疫原性以及使用TCR工程在体外靶向这些突变的可行性。体内疗效研究正在进行中。

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HLA I 类新抗原靶向TCR治疗中的CD8共受体依赖性

美国NCI；印度Chittaranjan NCI

背景：针对新抗原的TCR-T可以在导致超过90%癌症死亡的转移性实体上皮肿瘤中诱导肿瘤消退。靶向HLA I类和II类限制性肿瘤抗原的TCR与临床反应相关；然而，文献中对基因工程T细胞中共受体（CD8或CD4）的重要性尚未明确。增强TCR亲和力可以减少对CD8共受体的依赖，但这种影响在肿瘤新抗原特异性TCR中的程度目前尚不清楚。共受体依赖性可以通过HLA限制性TCR在其不匹配的起源T细胞（HLA-I:CD4, HLA-II:CD8）中的表现来定义。

方法：15个针对驱动新抗原（突变TP53和KRAS）的HLA I类限制性TCR在三个不同的实验中进行了检测，以评估共受体依赖性（图1）。健康供者的TCR转导T细胞通过FACS分离为4种纯TCR+共受体群体（CD3+、CD8+、CD4+、CD8+CD4+）。纯群体通过肽滴定法检测TCR亲和力，并通过荧光成像检测肿瘤杀伤能力。未分选的TCR转导T细胞通过HLA tetramer流式细胞术检测HLA-TCR相互作用（图1，实验#3）。最后，在该平台上评估了5个新的TCR和1个现有的TCR，这些TCR针对由HLA-A*11:01限制的KRAS G12V。

结果：观察到新抗原特异性TCR对CD8共受体依赖性的谱型与抗肿瘤效果密切相关。CD8共受体依赖性与已发表的新抗原特异性TCR在tetramer检测中的亲和力呈负相关（Spearmanr=-0.96，p=0.0028）。TCR功能亲和力和肿瘤杀伤能力作为评估共受体依赖性的指标并不完全准确（分别为r=-0.50，p=0.27；r=-0.57，p=0.20）。针对KRAS G12V A*11:01限制的新抗原的TCR也表现出类似的共受体依赖性谱型。其中两种新的TCR在肿瘤识别和tetramer检测共受体依赖性方面似乎优于现有的TCR（用于二期临床试验）。

结论：共受体依赖性是评估新抗原TCR-T中TCR性能的一种替代指标。CD8共受体非依赖性的HLA I类限制性TCR在CD4 T细胞中的功能似乎与抗肿瘤效果和新抗原TCR亲和力相关。已建立的tetramer检测方法是一种快速评估CD8共受体依赖性的方法。目前正在进行的研究正在评估体内纯化的共受体群体，以评估抗肿瘤效果，因为CD8共受体依赖性可能会影响临床新抗原特异性TCR载体的选择和生产过程。

图1 工作流程展示了纯共受体群体在三个不同检测中的初始开发：肽滴定/亲和力（1），肿瘤杀伤（2），HLA-新表位结合（3）

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鉴定和验证一种TCR，该TCR能够识别由TP53移码突变产生的HLA-A02:01呈递的共有表位

CureVac荷兰分公司；莱顿大学医学中心

背景：T细胞通过TCR识别来自肿瘤抗原的表位是有效破坏肿瘤细胞的前提。T细胞介导的免疫治疗的一个限制因素是缺乏在肿瘤细胞上高表达而在健康组织中不存在的共享靶点。新开放阅读框肽（NOPs）是由肿瘤DNA中的插入或删除产生的抗原类别，为设计T细胞受体疗法提供了机会。

方法：对于所有癌症基因组图谱中的患者预测了NOPs，并预测了来源于NOP的表位与HLA-A*02:01等位基因的结合。选取了前30个预测结合的表位，用于制备荧光标记的HLA-A*02:01 tetramer。多位健康供者的外周血单核细胞与混合肽负载的tetramer孵育。进一步扩增和富集抗原特异性CD8+ T细胞，并用于鉴定TCR的α链和β链。体外扩增或TCR工程化的CD8+ T细胞与过表达选定NOP的细胞或自然表达相同抗原的细胞系共培养。此外，编码NOP的mRNA构建物用于转染人moDC，并通过与体外扩增的抗原特异性CD8 T细胞共培养检测表位呈递。通过CD137和CD107a表达的增加检测抗原特异性CD8+ T细胞的活化。在剂量梯度实验中测试了工程化T细胞，以评估TCR亲和力。

结果：体外扩增识别与HLA-A*02:01结合的NOPs衍生肽段的抗原特异性CD8 T细胞取得了成功，共涉及15种肽段。在所有体外扩增的CD8+ T细胞群体中，只有2个群体识别了在HLA-A*02:01等位基因背景下呈递的同源肽段。其中一个TCR识别了来自TP53 NOP的表位。该TCR被克隆到健康供者的幼稚CD8+ T细胞中，在所有测试模型中，包括mRNA转染的moDC，这些T细胞能够特异性识别自然表达和呈递的TP53 NOP肽段。

结论：识别并验证了一种TCR，能够识别来自TP53 NOP的HLA-A*02:01表位。TP53 NOP在多种癌症类型中约1-3%的患者中表达。本研究显示了识别共享T细胞疗法靶点的可行性。

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识别针对Brachyury的新型TCR靶点，以开发针对脊索瘤和其他实体肿瘤的T细胞免疫疗法

MD安德森癌症中心；华盛顿大学

背景：Brachyury (TBXT) 在骨瘤（一种难治性罕见骨癌）以及肺癌和乳腺癌等实体瘤中广泛表达。本研究的目的是利用已建立的基于质谱的免疫肽组学工作流程，鉴定针对 Brachyury的免疫原性TCR靶点，以开发有效的基于ACT方法，用于治疗骨瘤及其他表达 Brachyury的实体瘤。

方法：从表达Brachyury的细胞系（包括脊索瘤和肺癌细胞系）中洗脱出与MHC结合的肽段，并进行串联质谱分析。候选MHC肽段的免疫原性通过内源性T细胞（ETC）工作流程从健康供者的PBMC中生成针对Brachyury的CTL来验证。通过细胞毒性试验确认生成的CTL对MHC匹配的Brachyury表达肿瘤靶标及其相关对照靶标的抗原识别。将从Brachyury特异性CTL克隆的全长TCR基因转入逆转录病毒载体，然后转移至第三方PBMC以构建具有重定向抗原特异性的TCR-T细胞。通过特异性杀伤试验和细胞因子释放试验对Brachyury特异性TCR-T的功能进行了验证。

结果：从DDA-MS中，发现了来自多个常见HLA等位基因的brachyury衍生MHC肽。选择了一个HLA-A*0201限制性肽进行免疫原性验证，通过使用HLA-A*0201健康供者的PBMC生成特异性CTL。成功生成的特异性CTL系能够以HLA-A*0201特异性方式杀伤表达Brachyury的肿瘤靶细胞，但不能杀伤Brachyury阴性或MHC不匹配的细胞靶标。冷靶抑制试验证实，CTL对靶标的特异性杀伤是通过识别Brachyury表达肿瘤细胞中自然呈现的同源肽介导的。将表达TCR基因的重组逆转录病毒载体转导至异体PBMC中。所得的TCR-T细胞在E:T比低至1:1.25时显示出高亲和力、Brachyury特异性肿瘤靶标杀伤。此外，当与HLA-A*0201/Brachyury表达的肿瘤靶细胞共培养时，TCR-T特异性增强了CD137、CD69、IFN-γ和TNF-α的表达。

结论：在串联质谱的帮助下，成功地识别了来自Brachyury的自然呈现的MHC肽，这些肽覆盖了80%的患者群体中常见的HLA等位基因。这些新识别的Brachyury表位可能是开发针对脊索瘤和其他实体肿瘤的疫苗或T细胞免疫疗法的潜在TCR靶点。此外，证明了Brachyury特异性TCR-T可以有效地重新定向抗原特异性杀伤，并可能为过继细胞疗法提供"现成"的T细胞试剂。

438

针对ALK阳性人类癌症的ALK TCR-T疗法开发

波士顿儿童医院；Dana Farber癌症研究所；哈佛医学院

背景：尽管ALK酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的开发显著改善了间变性淋巴瘤激酶（ALK）重排肿瘤患者（包括NSCLC和间变性大细胞淋巴瘤（ALCL））的临床预后，但获得性耐药不可避免地在2-3年内出现，限制了这些患者的生存期。本研究旨在鉴定针对之前通过质谱在ALK阳性细胞系和一名NSCLC患者的活检中鉴定出的2种人类ALK免疫原性肽段的HLA-B*07:02呈递的TCR克隆型，并开发用于ALK重排癌症的TCR-T细胞疗法。

方法：表达HLA-B*07:02的转基因小鼠分别接种了ALK肽RPRPSQPSSL或IVRCIGVSL。小鼠在第0天和第14天接受了两次皮下初免注射，随后在第28天和第56天接受了两次加强注射。第62天，分离并进行了激活的CD137(4-1BB)+/CD8+ T细胞的单细胞测序。鉴定出的扩增TCR克隆型（VDJ计数≥4）被克隆到逆转录病毒载体中，用于生产ALK TCR-T细胞。

结果：从接种了人类ALK肽RPRPSQPSSL和IVRCIGVSL的转基因HLA-B*07:02小鼠中分别鉴定出353和742种独特的TCR克隆型。单细胞 RNA-seq显示，扩增的克隆型（TCR 克隆型频率≥4）与非扩增的克隆型（TCR克隆型频率< 4）相比，Ccl3、Ccl4、Ccl1、IGNg 和 Xcl1 在接种 RPRPSQPSSL 和 IVRCIGVSL 的小鼠中显著上调（p<0.05）。基因富集分析（GSEA）证实了适应性免疫反应途径的上调，包括 T 细胞活化和增殖、IFN-γ 信号传导和细胞因子释放（p<0.05）。体外功能验证表明，从接种 RPRPSQPSSL 肽的转基因小鼠中分离出的扩增TCR克隆型能有效结合RPRPSQPSSL-dextramer（图 1A）。克隆型2.2显示出94% 的dextramer结合率，但对ALK阴性和HLA-B*07:02阳性的肿瘤细胞或ALK阳性和HLA-B*07:02阴性的肿瘤细胞没有杀伤作用。相反，观察到对ALK阳性和HLA-B*07:02阳性的人类肺癌和淋巴瘤肿瘤细胞有95%的杀伤活性（图1B）。这些数据证明克隆型2.2特异性识别由HLA-B*07:02在肿瘤细胞上呈递的ALK RPRPSQPSSL 肽，表现出强大的抗肿瘤活性。

结论：在这里，证明了通过HLA-B*07:02转基因小鼠疫苗鉴定的人类HLA-B*07:02限制性TCR-T细胞在体外表现出强大的抗肿瘤活性。这些发现为开发针对ALK重排肿瘤患者的ALK TCR-T细胞疗法铺平了道路。

图1 体外验证和人ALK TCR克隆型的杀伤活性。

385

识别靶向共享肿瘤抗原的TCR

Ilseyar Akhmetzyanova；Genentech

背景：免疫疗法的发展已经彻底改变了癌症治疗。然而，尽管免疫检查点抑制剂在部分患者中取得了成功，许多癌症仍然对这些治疗具有抵抗性。导致免疫检查点抑制剂疗效不佳的一个因素可能是肿瘤特异性T细胞数量不足。这一限制可以通过增加肿瘤特异性T细胞的数量来克服，例如通过过继细胞转移。事实上，肿瘤特异性CAR T细胞的转移在血液系统恶性肿瘤中已经显示出惊人的成功。相比之下，使用过继T细胞疗法治疗实体瘤仍然具有挑战性，但已有报道成功的CAR和TCR工程化T细胞以及TIL治疗实体瘤的案例。值得注意的是，2024年初FDA批准了TIL疗法用于黑色素瘤的治疗，这是首个获批用于实体瘤治疗的T细胞疗法。虽然TIL疗法通过扩增切除肿瘤中发现的抗原特异性T细胞来富集肿瘤特异性T细胞，但使用工程化TCR疗法时，需要一个强大的过程来选择肿瘤抗原特异性TCR，即将外源性TCR引入T细胞。

方法：在这里，描述了一种用于识别和表征针对共享肿瘤抗原的TCR的工作流程。通过非病毒方法对原代人T细胞进行工程改造，使其表达感兴趣的肿瘤特异性TCR，然后对其进行一系列体外试验，以表征候选TCR的效力和特异性。TCR工程化T细胞被评估其对表达正确HLA分子的永生化细胞系的反应性，这些细胞系可能或不表达感兴趣的靶抗原，从而可以区分靶向效力和脱靶活性。该系统允许早期剔除高交叉反应性的TCR，并优先考虑低交叉反应性的TCR进行更深入的安全性表征。证明，建立的临床前工作流程能够识别出在体内异种移植肿瘤模型中表现出活性的高效、安全的肿瘤特异性TCR。

结果：已建立的临床前工作流程能够识别出具有强大、安全的肿瘤特异性TCR，这些TCR在体内异种移植肿瘤模型中表现出活性。

结论：这是一个稳健的工作流程，可用于选择针对不同肿瘤抗原的候选临床TCR。