TCR-T细胞疗法在AML中的应用与挑战以及新兴策略

急性髓系白血病（AML）是成人中最常见的急性白血病，尽管在过去10年中靶向治疗取得了许多进展，但其死亡率仍然很高。所有患者的五年总生存（OS）率约为30%，而在70岁以上的患者中，这一比例降至不到10%。标准治疗方案是阿糖胞苷（cytarabine）和蒽环类药物（anthracycline）（称为"7+3"）的联合使用，随后对适合的患者进行异基因干细胞移植（ASCT）。不幸的是，即使在移植后，复发率仍然很高（40%），移植后复发的2年OS低于20%。对于年龄较大、身体条件不适合的患者，通常会联合使用低剂量阿糖胞苷（cytarabine）或地西他滨（decitabine）和阿扎胞苷（azacitidine）等去甲基化药物与Bcl-2抑制剂维奈托克（venetoclax）。虽然这种组合确实提供了生存益处，但结果仍然不佳，接受阿扎胞苷和维奈托克治疗的患者中位总生存期为14.7个月。因此，迫切需要额外的治疗方法来进一步延长AML患者的生存期。

免疫疗法的出现，如CAR-T，彻底改变了包括急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤在内的许多血液恶性肿瘤的治疗和预后。目前已有6款FDA批准的CAR-T疗法用于复发/难治性血液恶性肿瘤；中国也已批准了6款CAR-T细胞治疗产品，覆盖多种血液肿瘤（统计截止时间2024年10月）。尽管这些疗法的成功为AML带来了类似的治疗进展的希望，但免疫疗法在AML患者中的开发证明更具挑战性，主要原因是靶向抗原选择困难以及恶劣的AML肿瘤微环境。这里主要讨论了细胞疗法在AML中面临的障碍，和当前TCR-T在AML中的试验，以及该领域的新兴疗法。

AML中过继细胞疗法的挑战

抗原选择

在AML中采用细胞治疗的主要障碍仍然是抗原选择。在选择抗原时需要考虑四个重要原则：可及性、特异性、表达强度和分布以及白血病逃逸。理想的AML细胞治疗抗原应具备以下条件：①易于在细胞表面被识别；②特异于白血病细胞，不在正常髓系细胞上存在；③在足够多的白血病细胞上表达，成为有效的靶点；④不易逃避免疫识别。

虽然AML中有几种白血病特异性抗原，但其中许多是细胞内的，因此无法被CAR-T或CAR-NK细胞等疗法识别。例如，突变的NPM1在约30%的成人AML患者中发现。然而，NPM1是一种细胞内穿梭蛋白，在细胞表面无法被识别。其他AML特异性突变，如突变的IDH1也主要位于细胞内，因此难以通过CAR疗法靶向。细胞内靶点可以通过TCR-T疗法识别；然而，这些疗法在AML中的临床开发程度不如CAR疗法。最后，AML母细胞上存在一些正常造血干细胞上没有的细胞表面抗原，包括正在研究作为CAR靶点的NKG2D和CLL-1。

不幸的是，大多数表达在白血病细胞表面的可靶向抗原也存在于正常的髓系细胞上，例如跨膜受体CD33或IL-3受体CD123。非特异性疗法，如针对CD-19的CAR-T或双特异性抗体，在淋巴恶性肿瘤中是可以耐受的，因为持续的B细胞缺乏可以通过免疫球蛋白输注来解决。相比之下，没有干细胞救援的骨髓消融会导致普遍的致命性。因此，许多针对CD33和CD123的疗法正在作为移植前的桥梁进行研究，其中干细胞输注可以为骨髓消融提供救援。

接下来，重要的是目标抗原在足够多的白血病细胞上表达，以成为有效的靶点。AML是多克隆的，具有多个携带不同突变谱的白血病干细胞克隆（LSC）。如果某个克隆群体缺乏目标抗原的表达，它就可以逃避免疫识别，导致更快的复发。尽管CD33和CD123缺乏特异性，但由于这两种抗原在LSC中的高表达水平，它们已被研究作为靶点。一项对319名新诊断的AML患者的研究显示，接近90%的AML患者表达CD33，接近80%的患者表达CD123。几乎所有克隆都至少表达这两种抗原中的一种，这意味着联合方法在根除所有克隆群体方面可能非常有效。

最后，防止白血病逃逸，即AML母细胞避免被识别的能力，必须在选择抗原时加以考虑。这可以通过上调抑制性T细胞配体或下调目标抗原来实现。例如，在B-ALL中，已经证明初始对CD19 CAR-T细胞治疗有反应后的主要复发原因是CD19阴性复发。理想的目标抗原不应容易被AML母细胞下调，因为这可能导致治疗失败。

AML中的敌对肿瘤微环境

与实体瘤一样，AML也创造了一个不利于肿瘤微环境的情况，使得细胞疗法的渗透比其他血液恶性肿瘤更具挑战性，如图1所示。白血病细胞通过接触依赖性和非接触依赖性机制促进免疫抑制环境。AML母细胞可以下调MHC I类和II类表达，并增加检查点蛋白如PD-L1的表达，从而促进免疫逃逸。一个重要的抑制性表面受体是由白血病细胞上调的白细胞免疫球蛋白样受体B4（LILRB4），已被证明通过调节精氨酸酶信号传导来抑制T细胞活性和增殖。AML母细胞还释放活性氧（ROS）和吲哚胺2,3双加氧酶（IDO），这种酶抑制T细胞和NK细胞的增殖和功能。IDO催化色氨酸降解的限速步骤；IDO消耗导致色氨酸耗竭，最终抑制T细胞激活。IDO表达还导致Tregs的扩增，进一步促进免疫抑制环境。最后，母细胞招募额外的免疫抑制细胞，包括髓源性抑制细胞（MDSCs）和巨噬细胞。

MDSCs尤其对细胞疗法的有效性构成挑战，因为它们可以阻止T细胞激活并抑制NK细胞的肿瘤溶解。这些未成熟的髓系细胞能够干扰CD8+ T细胞早期激活过程中的多个步骤，包括IL-2分泌和反应性，并且还释放高水平的ROS，这些ROS可能对T细胞具有细胞毒性。研究表明，在实体瘤研究中，MDSC的扩张会降低CAR-T的疗效。CD33/CD123靶向细胞疗法的一个好处是，这种策略同样针对MDSCs，后者通常也表达CD33和CD123。据认为，这种对MDSC细胞的额外靶向可能会增强CAR-T的整体疗效。

图1 AML中敌对肿瘤微环境的概述。展示了由AML母细胞创造的肿瘤微环境，这些母细胞释放ROS和IDO，两者均抑制正常的NK和T细胞的功能及增殖。母细胞还招募其他免疫抑制细胞进入微环境，包括MDSCs、Tregs和巨噬细胞。这些细胞减少了T细胞的细胞因子产生和NK细胞对肿瘤细胞的裂解能力。最后，图中还显示了非特异性和白血病相关抗原，包括CD33、CD123、CLL-1和NKG2DL。

AML中的免疫细胞耗竭

产生有效的细胞治疗的另一个挑战是AML中常见的免疫细胞耗竭，特别是在T细胞和NK细胞中，在慢性状态下（如恶性肿瘤）反复暴露于抗原后会出现表型变化和功能下降。在功能状态下，当识别到抗原时，naïve T细胞通常会被激活并分化为效应T细胞，这些效应T细胞不仅直接杀死抗原来源（在AML中，即母细胞），还会分泌细胞因子以进一步招募更多的免疫细胞。效应T细胞最初会增殖，然后一旦目标抗原被清除，大多数效应T细胞会死亡，只有少量T细胞会在IL-7和IL-15的驱动下持续存在作为记忆细胞。这些记忆T细胞能够下调激活信号并进入静息状态，直到再次受到目标抗原的刺激。

相比之下，AML会导致T细胞因持续暴露于白血病抗原而进入耗竭状态。【Signatures of CD8+ T cell dysfunction in AML patients and their reversibility with response to chemotherapy】分析了72名AML患者的T细胞，结果显示这些患者与健康对照组相比，终末分化效应T细胞的频率更高，而naïve T细胞的频率更低。重要的是，还发现对诱导化疗无反应的患者比完全缓解（CR）的患者更可能具有更高的终末分化细胞比例。耗竭的CD8+T细胞失去产生IL-2、增殖和有效杀伤肿瘤细胞的能力。耗竭的CD8+T细胞还会上调抑制性受体，如CTLA4、LAG3、TIM3和PD-1。一项研究检查了AML患者骨髓中的T细胞，发现1/3的T细胞表现出严重的功能障碍和较少的增殖。白血病干细胞还可以导致NK细胞耗竭，这些细胞在杀伤试验中表现出功能下降，并且分泌IFN-γ等细胞因子的能力减弱。

这种免疫细胞耗竭可能导致自体细胞疗法的体外扩增质量较低。【Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia】这项针对慢性淋巴细胞白血病患者使用CD19靶向的CAR-T的研究发现，对CAR-T无反应的患者的T细胞表现出更多的耗竭迹象和较差的增殖能力，无论是在基因组水平还是表型水平。转录组分析显示，无反应者的效应分化、糖酵解、耗竭和凋亡相关基因表达较高，而有反应者则表现为IL-6/STAT3信号特征的T细胞富集。功能强大的CAR-T细胞在体内表现出强劲的扩增和细胞因子分泌。【Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas】同样发现，与无反应者相比，接受CD19 CAR-T细胞治疗并成功治愈的大B细胞淋巴瘤患者存在差异基因表达。达到CR的患者中，CD8记忆T细胞表型比部分或无反应者更为丰富。同种异体CAR-T和CAR-NK因此成为克服免疫细胞耗竭的有吸引力的选择。

当前TCR-T疗法在AML中的试验

AML中TCR-T疗法的基本原则

CAR-T和CAR-NK细胞在AML中的一个重要限制是无法靶向细胞内抗原。与能够识别与MHC分子复合的细胞内或细胞外肽段的天然TCR相比，CAR只能以HLA非依赖的方式识别表面抗原。因此，TCR-T成为针对细胞内AML抗原的有吸引力的选择。工程化的TCR构建体类似于内源性TCR，可以识别由抗原呈递细胞上的MHC I类分子呈递的肽段（包括细胞表面和细胞内抗原）。图2展示了工程化T细胞治疗中CAR与TCR的结构差异。

TCR-T细胞已被证明比CAR-T细胞具有更高的抗原敏感性和更低的细胞因子释放。然而，TCR-T的一个重要考虑因素是需要HLA匹配，因为TCR受HLA限制。因此，潜在受益的患者群体比CAR-T要窄得多。

图2 CAR-T、CAR-NK和TCR-T构建体的结构。展示了当前细胞治疗方法的重要差异。用于CAR-T和CAR-NK细胞的CARs相似，包含一个胞外抗原识别域，能够识别细胞表面的抗原，铰链区、跨膜区、共刺激区和胞内信号传导区。TCR-T细胞具有合成的TCR，可以通过MHC-肽复合物识别表面和胞内抗原。

白血病相关抗原是TCR-T疗法的目标

在AML的TCR-T治疗的临床前研究中，已报道了几种与白血病相关的细胞内抗原。这些包括WT1、HA-1、TERT、Survivin和PRAME。HA-1是一种次要组织相容性抗原。针对仅在受者造血细胞上表达而在非造血细胞上不表达的次要组织相容性抗原，理论上可以在ASCT后最大化移植物抗白血病效应，同时最小化移植物抗宿主病（GVHD）。在一项I期临床试验中【HA-1H T-cell receptor gene transfer to redirect virus-specific T cells for treatment of hematological malignancies after allogeneic stem cell transplantation: a phase 1 clinical study】，从HA-1H阴性的干细胞供者中制备了HA-1H TCR-T细胞，并将其输注给5名高危AML患者，这些患者在接受ASCT后为HA-1H阳性。尽管没有观察到显著的副作用，包括GVHD，但总体疗效不幸过低，无法进一步研究这种方法。同样，针对PRAME（黑色素瘤优先表达抗原）的TCR-T药物MDG1011也显示出类似的不良反应率。

迄今为止，对于TCR-T而言，最具前景的目标是WT1。WT1是一种在AML母细胞中过度表达的转录因子，在正常组织中的表达有限。2017年，【Safety and persistence of WT1-specific T-cell receptor gene-transduced lymphocytes in patients with AML and MDS】创建了一种针对WT1肽的TCR-T细胞。重要的是，这种TCR只能在HLA-A*24:02的背景下识别WT1肽，因此患者选择受到限制。8名患有AML或MDS的患者接受了TCR-T细胞治疗。该疗法总体上耐受性良好，但疗效不佳，只有2名患者显示出反应迹象，母细胞计数短暂下降。还有研究【T Cell Receptor Gene Therapy Targeting WT1 Prevents Acute Myeloid Leukemia Relapse Post-Transplant】在ASCT后高复发风险的AML患者中测试了WT1 TCR-T，选择了移植后28天无疾病证据的12名患者，接受至少一次TCR治疗。体内T细胞持续时间有限的患者接受了第二次剂量。从第一次输注后的中位随访44个月来看，所有患者均存活且无疾病证据。这与类似患者的复发或死亡率45%相比显著改善。此外，未发现对正常组织的毒性，输注也耐受良好。

这两项试验中感知到的疗效差异可能与患者的临床状态（复发性疾病患者与无疾病证据患者）或用于创建TCR-T细胞的工程方法有关。前者研究是使用逆转录病毒载体将内源性TCR基因转移到自体淋巴细胞中。后者研究则从健康供者中分离出TCR，然后将其插入针对Epstein-Barr病毒的供者CD8+ T细胞中。如前所述，与自体细胞相比，健康供者的淋巴细胞具有显著优势，因为T细胞耗竭的问题得到了缓解，从而能够制造出质量更高、扩增和持久性更好的细胞产品。

2019年发表了一项I期研究【A Phase I Study Evaluating the Safety and Persistence of Allorestricted WT1-TCR Gene Modified Autologous T Cells in Patients with High-Risk Myeloid Malignancies Unsuitable for Allogeneic Stem Cell Transplantation】，显示自体WT1-TCR细胞在AML患者中持续存在。该研究选择了6名高危疾病且在T细胞输注时处于完全形态学缓解状态的AML患者。所有患者在28天时均可检测到TCR-T细胞；所有AML患者在中位数为12个月时仍存活。唯一报告的不良事件是一名可能患有CRS的患者，该患者未使用托珠单抗（tocilizumab）进行管理。因此，鉴于在自体和异体试验中，当患者在输注时无疾病证据时结果更为有利，疾病状态可能是需要考虑的重要因素。

与CAR-T和CAR-NK一样，目前也在努力提高TCR-T构建体的持久性，例如加入IL-15等细胞因子。还有正在进行的努力旨在创建多肿瘤抗原特异性T细胞，以实现组合靶向。然而，TCR-T疗法受到HLA匹配的限制，这最终会限制能够接受这些疗法的患者数量。

未来方向

一种在临床前开发中兴起的细胞疗法，可以解决HLA限制问题，利用了γδ T细胞。这些细胞是一类淋巴细胞的亚群，表达不同于典型的αβ受体的TCR，并且作为先天免疫系统和适应性免疫系统之间的桥梁。尽管对γδ T细胞的了解较少，但已知这些细胞通过识别人嗜乳脂蛋白（一种将AML抗原呈递给γδ T细胞的膜蛋白）发挥抗白血病活性，随后通过释放颗粒酶B和穿孔素表现出强烈的细胞毒性。与NK细胞类似，由于其HLA非依赖性的抗原处理方式降低了GVHD的风险，且不需要HLA匹配，因此它们是过继细胞疗法的有吸引力的目标。一个主要挑战是γδ T细胞的分离，因为它们在血液中的比例远小于αβ T细胞。目前正在进行创建CAR-γδ T细胞的努力，但尚未有临床数据公布。然而，有一些异基因供体γδ T细胞输注（未进行任何CAR工程改造）在ASCT后的数据，总体上较为有利，但仍处于早期阶段。

另一个有前景的发展是多抗原靶向，随着多重编辑技术的出现，利用CRISPR-Cas9可以一次性敲除多个基因。有研究编辑了供体HSCs，同时改变了FLT3、CD123和KIT的表达，随后进行了针对这三个抗原的CAR-T细胞治疗。编辑后的HSCs保持了正常的植入能力，并且在体外对组合CAR-T细胞治疗具有抵抗力，而白血病母细胞则被有效清除。这项临床前研究尚处于早期阶段，但为避免白血病逃逸提供了一种有希望的方法。

最后，还有其他一些针对AML的临床前研究目标，包括CD70、IL-1RAP和TIM3。这些目标的临床试验可能在未来的几年内开始。

Chapuis AG, et al. T cell receptor gene therapy targeting WT1 prevents acute myeloid leukemia relapse post-transplant. Nat Med. 2019; 25(7):1064-1072.

van Balen P, et al. HA-1H T-cell receptor gene transfer to redirect virus-specific T cells for treatment of hematological malignancies after allogeneic stem cell transplantation: a phase 1 clinical study. Front immunol. 2020;11:1804.

Tharakan S, et al. Adoptive cell therapy in acute myeloid leukemia: the current landscape and emerging strategies. Leuk Lymphoma. 2024; 25:1-14.

Tawara I, et al. Safety and persistence of WT1-specific T-cell receptor gene-transduced lymphocytes in patients with AML and MDS. Blood. 2017; 130(18):1985-1994.

Deng Q, et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas. Nat Med. 2020;26(12):1878-1887.

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