兔单抗的可开发性：非经典二硫键或非其成药阻碍

兔单抗凭借其精细的表位识别、高亲和力、高特异性和稳定性，已成为研究、诊断和治疗应用中的杰出试剂。这些特性也使兔子成为抗体体内发现极具吸引力的替代品。

兔抗与其他物种的抗体相比，结构略有不同。兔IgG一个显著特征就是存在非经典二硫键。这些键常见于kappa链Cys80和Cys170（C80-C170）之间，以及重链CDR1 Cys35a和CDR2 Cys50（C35a-C50）之间。已有研究对C80-C170二硫键进行表征，发现此二硫键的存在有助于提升抗体的热稳定性。与C80-C170二硫键不同，含有C35a-C50二硫键的兔单抗通常被认为具有一种"负担"，即使其他方面的性能符合要求，通常也会被排除于临床治疗候选抗体之外。为了解兔单抗非经典二硫键对抗体可开发性的影响，研究人员对人鼠交叉PD-1人源化兔单抗进行了改造与评价。

人鼠交叉PD-1兔单抗的制备

程序性死亡受体1（PD-1）是重要的免疫检查点受体，通过与两个配体PD-L1和PD-L2的作用抑制T细胞的活化及细胞因子的产生，已被证实是癌症免疫疗法最有前途的靶点之一。临床前小鼠模型是进行药效、药代动力学和毒性研究的重要工具，但开发出人鼠交叉的PD-1抗体难度较高。研究人员利用单B细胞抗体发现平台开发了PD-1兔单抗，筛选出的所有人鼠交叉且阻断PD-L1的PD-1抗体都含有C35a-C50二硫键，这表明这种二硫键可能具有某些功能作用，并且可能影响这些候选抗体在人源化后的进一步发展。

为了进一步了解这种重链间非经典二硫键对抗体稳定性和抗原结合活性的影响，研究人员选择了亲和力最高的人鼠交叉PD-L1阻断兔单抗（rbt1340）人源化。rbt1340对hPD-L1和mPD-L1显示完全阻断（最大抑制作用大于90%），同时与hPD-1和mPD-1过表达细胞株具有较强的结合。人源化后获得的h1340CC（CC指包含C35a-C50二硫键）对三种PD-1表现出最高的亲和力，且对hPD-1/hPD-L1和mPD-1/mPD-L1的抑制作用最高。与rbt1340相比，h1340CC在物种间的亲和力损失仅在2~3倍。

h1340CC Fab与PD-1结合构象

在分辨率为2.3 Å条件下对h1340CC Fab与hPD-1结合的晶体结构进行解析，从残基Arg30到Arg143对PD-1进行建模（对应于残基59-60、71-72和85-92的无序loop区除外），观察到h1340CC Fab和PD-1之间存在广泛的结合界面，且与PD-L1的结合界面部分重叠。

h1340CC Fab与PD-1的相互作用界面

h1340CC的所有CDR参与与PD-1的结合，并与PD-1形成三个主要的相互作用界面。

图1 h1340CC Fab与hPD-1结合构象

第一主要相互作用界面由PD-1残基Trp32、Lys131和Gln133形成，它们在由CDR L1、L2、L3和H3残基形成的口袋中结合（图1b）。PD-1残基Trp32和Gln133分别与CDRL1 残基Asn31和Tyr28形成氢键。其他关键接触涉及PD-1残基Lys131，它与CDRL3 Tyr92骨架羰基形成氢键，并与CDRL1残基Asp32和CDRL3残基Asp95形成盐桥，PD-1残基Ala132与CDRL3 Asp95形成氢键。

第二个界面由侧链形成--PD-1残基Thr76、Glu136和Arg139与CDRH3残基Ala98、Gly99和Gly100a之间的极性相互作用，以及PD-1残基Ile134和CDRH3残基Tyr100c之间的氢键（图1c）。

PD-1残基Asn66和CDRH1残基Ser31之间的氢键以及PD-1（残基Val64、Ile126、Leu128、Ala132和Ala134）上的疏水斑块与CDRH1、H2和H3的芳香基团和极性基团的脂肪族部分相互作用，形成了第三个主要相互作用界面（图1d）。

h1340CC的物种交叉分析

人、食蟹猴和小鼠PD-1的序列分析解释了h1340CC物种交叉反应的原因：hPD-1与h1340CC Fab CDR直接接触的关键残基在cyno PD-1中都是保守的，而在mPD-1中，这些残基中存在三处不同（图2）。事实上mPD-1中保守的Gln133Lys取代可能可以保持与CDRL1残基Asn31的氢键，但Tyr68Asn和Arg139Gly取代可能导致CDRH1和CDRH3失去两个氢键。

图2 人、食蟹猴和小鼠PD-1的表位比较

C35a-C50对h1340CC结合构象的影响

半胱氨酸残基C35a和C50位于面向轻链的相邻β折叠股中，不参与与hPD-1的任何直接相互作用。但二硫键对CDRH3残基L100e和L100h具有支撑作用，可能在稳定CDRH3构象及其与hPD-1的广泛相互作用界面上发挥重要作用（图3）。此外，在靠近二硫键的地方，CDRH1残基W34和CDRH2残基Y52与hPD-1残基Ile126、Leu128、Ala132和Ile134形成疏水斑块。

图3 h1340CC二硫键的结构背景

h1340CC重链以淡绿色表示，其关键残基以深绿色表示；C35a-C50二硫键用红色表示；与hPD-1残基Ile126、Leu128、Ala132和Ile134形成疏水相互作用的关键残基以球棍模型表示；人类和小鼠PD-1的不同残基（Y68N和Q133K）用亮粉色表示。

基于结构和序列分析的亲和力成熟

在理解相互作用结构的基础上，研究人员试图减轻去除非经典C35a和C50二硫键而导致的亲和力损失。去除二硫键可能会影响CDRH1-H2区域向CDRH3残基L100e和L100h的折叠，从而影响CDRH1或H2、H3构象，导致与hPD-1结合的变化。

研究人员首先尝试将C35、C50分别突变为Ser和Ala，发现对hPD-1的亲和力降低~2.5倍，对mPD-1的亲和力降低~4倍。这可能是由于mPD-1中Y68N和R139G的差异，两个氢键的潜在丢失可能使mPD-1更容易受到去除二硫键导致的弱相互作用的影响。又尝试将C35、C50突变为疏水性氨基酸（Val、Ile和Leu），将C50保守突变为Ser或Thr，结果发现与h1340SA相比，这些变体均未产生更高的亲和力。

进一步的结构分析发现，将残基I35和/或A52a突变为较大的残基（图3）可能可以改善疏水核心的折叠，从而支撑β折叠，改善或稳定W34和Y52与hPD-1的相互作用。通过将h1340SA、h1340VS（C35a→V，C50→S）的I35突变为Leu或Met，A52a突变为Val、Ile或Leu，进一步测试变体的亲和力。具有额外突变I35→L和A52a→V的h1340SA变体（h1340SALV）对hPD-1的亲和力损失在亲本克隆h1340CC两倍内得到改善。

功能性和免疫原性比较

通过表面等离子体共振（SPR）比较h1340CC与h1340SALV和hPD-1、CynoPD-1和mPD-1的亲和力活性，发现KD值差异小于2.5倍（表1）。

表1 h1340CC和h1340SALV与三种PD-1的亲和力

AntibodyHuman PD-1 KD/nMCyno PD-1 KD/nMMouse PD-1 KD/nM

h1340CC0.45 ± 0.070.63 ± 0.141.91 ± 0.23

h1340SALV0.80 ± 0.051.51 ± 0.083.82 ± 0.11

通过FACS评估两株抗体与hPD-1、mPD-1过表达细胞株结合活性，发现活性基本一致。在阻断PD-1/PD-L1相互作用方面的表现与上市药物帕博利珠单抗和纳武利尤单抗（Nivolumab）相似（图4）。

图4 h1340CC和h1340SALV在结合和阻断方面的功能表征

评估两株抗体的潜在免疫原性是通过FACS检测健康供体的外周血单一核细胞（PBMC）与抗体共孵育7天后CD4 T细胞的增殖情况。使用刺激指数（SI），即存在或不存在测试抗体时BrdU/CD3CD4 T细胞的百分比比率确定每个供体的反应。结果表明，两株抗体在阳性供体中诱导的T细胞增殖具有相似的SI值（13~17%），即都具有低免疫原性潜力。

可开发性评估

抗体可开发性评估主要包括抗体的热稳定性、化学稳定性、黏度与浊度。

在高浓度（150 mg/mL）下对h1340CC和h1340SALV进行热稳定性检测，并评估其转化为高浓度制剂的可能性。在30°C下储存一个月后，通过尺寸排阻色谱法（SEC）评估了抗体的聚体和片段化程度，并通过离子交换色谱法（IEC）评估了电荷异构体的变化。尽管非经典二硫键可能导致半胱氨酸不成对或二硫键乱配，从而导致抗体聚集，但实际上未观察到h1340CC的聚集增加。此外，虽然h1340SALV IEC观察到主峰的降幅更大，但这种变化在测定变异性范围内，表明两种变体在高浓度热应力下表现相似。

使用2,2'-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸盐（AAPH）对两株抗体进行化学胁迫，可以观察到h1340SALV在W34处的氧化高于h1340CC（分别为36%和1%），表明该区域的溶剂可及性增加。根据结构分析，该残基与非经典二硫键的紧密接近，去除二硫键会破坏该区域的稳定性并增加CDRH1环的灵活性。在热应激或氧化应激后，通过肽图分析未观察到任何天冬酰胺、天冬氨酸、蛋氨酸或色氨酸残基在任一变体的CDR中的氧化差异。

除了热稳定性和化学稳定性外，抗体的黏度也是影响生产过程的关键特性。在高离子强度缓冲液中测量了两株抗体在高浓度下的黏度，h1340CC的黏度略高于h1340SALV，都远低于不可开发的黏度阈值，因此不会对生产过程构成风险。

最后，为了了解对给药的影响，将高浓度样品透析到PBS中评估两株抗体的溶解度，透析后测量的浊度没有观察到差异。

小结

非经典二硫键在兔、鸡、骆驼、鲨鱼和牛抗体中普遍存在，它们在产生多样化的抗体库中起着至关重要的作用，扩大与互补位作用空间，介导与抗原间的相互作用。之前普遍认为，为了将源自这些物种的有价值的单克隆抗体改造为治疗药物，在药物开发过程中必须去除CDR内部和外部的非经典二硫键。

在兔单抗中，轻链结构域之间的非经典C80-C170二硫键可以很容易地通过丙氨酸诱变去除。相比之下，重链CDR1和CDR2之间的非经典C35a-C50二硫键不易去除。因此，尽管在其他方面具有良好的特性，此类抗体通常不会被优先考虑。事实上，在去除含有非经典C35a-C50二硫键的PD-1兔源单克隆抗体的过程中发现，通过结构序列分析可以有效改善抗体特性，也证明了兔单抗中发现的非经典二硫键并不一定构成治疗性抗体开发的阻碍。

正确的评估兔源抗体的可开发性，减少对兔源抗体成药性的偏见可以丰富候选抗体分子数量，从而筛选到更优的临床候选药物。未来也需要更多的研究和临床验证证明结果的普遍性。

参考文献

Liang WC., Xi H, Sun D., et al. Structure-and machine learning-guided engineering demonstrate that a non-canonical disulfide in an anti-PD-1 rabbit antibody does not impede antibody developability. mAbs, 2024:16(1).

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