甲基转移酶METTL3抑制剂在体内和体外抑制前列腺癌进展

前列腺癌（Prostate cancer，PCa)是全球男性中最常见的恶性肿瘤之一，也是导致男性癌症死亡的第二大原因。尽管雄激素受体（Androgen receptor，AR）信号通路在前列腺癌进展中至关重要，但长期雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy，ADT）最终会失败，导致致命的去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。目前，AR靶向治疗的抗性导致前列腺癌的治疗仍存在挑战，寻找新的治疗靶点变得尤为重要。近年来表观遗传学的快速发展为研究 PCa 的进展、耐药性和潜在治疗靶点提供了新的途径。

RNA修饰是一种重要的表观遗传调控机制，RNA N6-甲基腺苷（m6A）是人类最丰富的RNA修饰类型，在mRNA剪接、翻译和降解的转录后调控中起关键作用。在许多癌症类型中，m6A调节酶的异常表达与肿瘤发生、转移、耐药性和癌症干细胞自我更新有关。m6A调控因子METTL3是前列腺癌（PCa）多种进展过程中的重要调控基因。已有报道称METTL3抑制剂在某些癌症类型中具有强大的肿瘤抑制能力。然而，METTL3抑制剂对PCa进展的详细影响和机制以及它们与其他药物的潜在协同作用尚不清楚。

2024年10月，中国医学科学院药物研究所Wu Meng团队、北京医院侯惠民团队和浙江师范大学周金明团队合作在《Biomedicine & Pharmacotherapy》期刊发表题为"METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor"的科研成果。研究通过免疫组化染色、Western blot、qRT-PCR等方法揭示前列腺癌PCa中METTL3 过表达并与不良预后相关。研究还表明MTTTL3 抑制剂STM2457可以降低PCa细胞的m6A水平，从而抑制其增殖、集落形成、迁移、侵袭和干性。此外，STM2457在体内抑制细胞来源的异种移植物（CDX）和患者来源的异种移植物（PDX）PCa 模型的进展。MeRIP-seq分析与生物学验证相结合揭示STM2457主要通过 IGFBP3/AKT 通路影响PCa细胞中的多个生物过程。TM2457诱导DNA损伤，并在体外和体内显示出与 PARP 抑制剂奥拉帕尼（Olaparib）的协同抗PCa作用。总体而言，本研究为靶向 RNA m6A 修饰治疗 PCa 提供了一种新的治疗策略。

标题：METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor（METTL3抑制剂通过IGFBP3/AKT通路抑制前列腺癌进展并与PARP抑制剂协同作用）

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

影响因子： IF 6.9

技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq

研究设计：

① 使用免疫组化染色、Western blot、qRT-PCR等方法检测METTL3在前列腺癌组织和细胞系中的表达水平。

② 通过MeRIP-seq分析和生物学验证，研究STM2457对前列腺癌细胞中m6A修饰的影响。

③ 在体外细胞实验和体内动物模型中评估STM2457对前列腺癌进展的影响。

④ 通过药物协同作用实验，研究STM2457与PARP抑制剂的联合治疗效果。

图形摘要

结果图形：

1. METTL3 在大多数 PCa 肿瘤和细胞系中过表达

图1. 在前列腺癌（PCa）肿瘤和细胞系中METTL3的过表达和m6A水平。

A. 通过免疫组化（IHC）染色检测了74名PCa患者的肿瘤和相邻正常组织中METTL3的蛋白表达水平

B. 对图1A中IHC结果的定量分析。

C. 在TCGA数据库中，检测了PCa肿瘤和相邻正常组织中METTL3的mRNA表达水平。

D. 通过Western blot检测了12名PCa患者的肿瘤和相邻正常组织中METTL3的蛋白表达水平。

E. 对图1D中Western blot结果的定量分析。

F. 通过qRT-PCR检测了12名PCa患者的肿瘤和相邻正常组织中METTL3的mRNA表达水平。

G. 检测12名PCa患者的肿瘤和相邻正常组织中总RNA的m6A水平。

H. 通过TCGA数据库分析，高METTL3表达与PCa的预后不良显著相关，P＜0.05。

I. 通过Western blot检测了5种不同的PCa细胞系和1种正常成人前列腺上皮细胞系中METTL3的蛋白水平。

J. 对图1I中Western blot结果的定量分析。

K. qRT-PCR检测5种不同PCa细胞系和1种正常成人前列腺上皮细胞系中METTL3 mRNA表达水平

L. 检测了5种不同PCa细胞系和1种正常成人前列腺上皮细胞系中总RNA的m6A水平。（实验进行三次重复。结果表示为均值±标准差。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001与对照组相比。）

2. METTL3抑制剂在体外抑制PCa细胞和类器官活力

图2：STM2457对体外前列腺癌细胞和类器官活力的影响。

A. DU145、22Rv1、LNCaP、C4-2和PC-3细胞用DMSO、STM2457 1.25μM、2.5μM、5.0μM和10.0μM处理24小时，检测不同细胞系和不同处理组的总RNA m6A水平。

B. 22Rv1、LNCaP、C4-2、DU145和PC-3细胞用不同浓度的STM2457处理6天，通过CCK8实验检测细胞增殖。

C. 用DMSO、STM2457 1.25μM、2.5μM、5.0μM、10.0μM和20.0μM处理22Rv1、LNCaP、C4-2、DU145和PC-3细胞12-14天，进行结晶紫染色法检测。

D. 对图2C中集落形成结果的定量分析。

E. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM处理22Rv1和DU145细胞24小时，通过Transwell迁移实验检测细胞迁移活性。

F. 对图2E中Transwell迁移实验结果的定量分析。

G. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM处理22Rv1和DU145细胞24小时，通过Transwell侵袭实验检测细胞侵袭活性。

H. 对图2G中Transwell侵袭实验结果的定量分析。

I. 用DMSO、STM2457 5.0μM和20.0μM处理22Rv1和DU145细胞48小时，通过高内涵成像分析系统进行细胞运动跟踪。

J. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM处理22Rv1和DU145细胞2周，进行成球试验(spheroid formation assay)检测。

K. 3个前列腺癌患者源类器官用DMSO、STM2457 2.5μM、5.0μM和10.0μM处理约10天，然后通过显微镜观察。

L. 3个前列腺癌患者源类器官用不同浓度的STM2457处理约10天，检测类器官活力。

3. METTL3抑制剂在体内抑制PCa进展

图3：STM2457对前列腺癌CDX和PDX模型体内进展的作用。

A. 22Rv1细胞异种移植肿瘤经对照或每天50mg/kg STM2457处理3周，最后一天拍摄肿瘤照片（n=4）。

B. 每隔一天监测一次肿瘤体积增长。

C. 最后一天用电子秤测量肿瘤重量。

D. 每隔一天用电子秤监测小鼠体重。

E. 检测肿瘤组织的总RNA m6A水平。

F. 对收获的肿瘤进行增殖（Ki-67）和凋亡（裂解的caspase 3）水平的免疫组化分析，

G. 对图3F中IHC结果的定量分析。

H. 前列腺癌患者肿瘤的异种移植肿瘤经对照或每天50 mg/kg STM2457处理3周，最后一天拍摄肿瘤照片（n=5）。

I. 每三天监测一次肿瘤体积增长。

J. 最后一天用电子秤测量肿瘤重量。

K. 每三天用电子秤监测小鼠体重。

L. 检测肿瘤组织的总RNA m6A水平。

M. 对收获的肿瘤进行增殖（Ki-67）、神经内分泌分化（SOX2）和DNA损伤（γ-H2AX）水平的免疫组化分析。

N. 对图3M中IHC结果的定量分析。

4. PCa细胞中受METTL3抑制剂影响的信号通路

图4：STM2457导致前列腺癌细胞的全基因组m6A修饰和转录组变化。

A. 在用DMSO（n=3）或STM2457 10μM（n=3）处理的22Rv1细胞中进行MeRIP-seq分析，不同处理组的m6A peaks强度以小提琴图表示。

B. 差异m6A峰（n=25369）分布在5'UTR、3'UTR、起始密码子、终止密码子、内含子、间隔区或CDS区域。

C. 维恩图展示通过RNA-seq和MeRIP-seq检测的显著表达或m6A峰变化（FDR<0.05, p<0.05）的基因数量。

D. DMSO和STM2457组中差异m6A标记基因热图。

E. 在DMSO与STM2457组中，m6A峰和mRNA表达水平显著变化的基因被分为4类：hypo-down（m6A峰下调，mRNA下调）；hypo-up（m6A峰下调，mRNA上调）；hyper-down（m6A峰上调，mRNA下调）；hyper-up（m6A峰上调，mRNA上调）。

F-G. 下调最多的前10个编码基因的m6A峰（F）和最显著的mRNA表达水平变化（G）。

H. DMSO和STM2457组转录组的KEGG分析。

I. GSEA揭示STM2457在22Rv1细胞中显著下调细胞周期、氧化磷酸化和DNA复制途径。

5. IGFBP3/AKT通路是METTL3抑制剂抗前列腺癌（PCa）效果所必需的

图5：STM2457通过IGFBP3/AKT通路抑制前列腺癌细胞活力。

A. MeRIP-seq检测22Rv1细胞中DMSO或STM2457组IGFBP3 mRNA 3'UTR的m6A峰分布差异。

B. 22Rv1细胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM处理48小时，通过qRT-PCR检测IGFBP3 mRNA水平，并与GAPDH归一化。

C. C4-2细胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM处理48小时，通过qRT-PCR检测IGFBP3 mRNA水平，并与GAPDH归一化。

D. LNCaP细胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM处理48小时，通过qRT-PCR检测IGFBP3 mRNA水平，并与GAPDH归一化。

E. C4-2和22Rv1细胞用DMSO、STM2457 2.5μM、5.0μM和10.0μM处理48小时，通过western blot分析检测IGFBP3蛋白水平。

F. 对图5E中western blot结果的定量分析。

G. C4-2和22Rv1细胞用DMSO或STM2457 10.0μM处理48小时，通过western blot分析检测p-AKT、AKT和IGFBP3蛋白水平。

H. 对图5G中western blot结果的定量分析。

I. C4-2和22Rv1细胞用si-IGFBP3或si-NC处理24小时，通过qRT-PCR检测IGFBP3 mRNA水平，并与GAPDH归一化。

J. C4-2和22Rv1细胞用si-IGFBP3或si-NC处理24小时，通过western blot分析检测IGFBP3蛋白水平。

K. C4-2和22Rv1细胞用si-IGFBP3或si-NC处理24小时，然后用DMSO或STM2457 10μM处理24小时，通过western blot分析检测p-AKT、AKT和IGFBP3蛋白水平。

L. C4-2细胞用si-IGFBP3或si-NC处理24小时，然后用STM2457 5.0μM处理24小时、48小时、72小时和96小时，通过CCK8实验检测细胞活力。

M. 22Rv1细胞用si-IGFBP3或si-NC处理24小时，然后用STM2457 5.0μM处理24小时、48小时、72小时和96小时，通过CCK8实验检测细胞活力。

N. C4-2和22Rv1细胞用si-IGFBP3或si-NC处理24小时，然后用DMSO或STM2457 5.0μM处理12-14天，进行结晶紫染色分析。

O. 对图5N中集落形成结果的定量分析。

6. METTL3抑制剂与PARP抑制剂联合使用在体外显示出增强的抗PCa活性

图6：STM2457在体外与PARP抑制剂显示出协同抗前列腺癌效果。

A. C4-2和22Rv1细胞用DMSO或STM2457 10.0μM处理72小时，通过western blot分析检测p-AKT、AKT和γ-H2AX蛋白水平。

B. 对图6A中相对γ-H2AX蛋白水平的定量分析。

C. 22Rv1细胞用DMSO或STM2457 10.0μM处理72小时，通过免疫荧光检测γ-H2AX蛋白水平。

D. 22Rv1细胞用指定浓度的STM2457与奥拉帕尼联合处理144小时，通过CCK8实验检测细胞增殖抑制活性。

E. 计算STM2457与奥拉帕尼在22Rv1细胞中的协同得分。

F. C4-2细胞用指定浓度的STM2457与奥拉帕尼联合处理144小时，通过CCK8实验检测细胞增殖抑制活性。

G. 计算STM2457与奥拉帕尼在C4-2细胞中的协同得分。

H. 22Rv1和DU145细胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奥拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM与奥拉帕尼5.0μM联合处理12-14天，进行结晶紫染色。

I. 对图6H中集落形成结果的定量分析。

J. 22Rv1和DU145细胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奥拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM与奥拉帕尼5.0μM联合处理24小时，通过Transwell迁移实验检测细胞迁移活性。

K. 22Rv1和DU145细胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奥拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM与奥拉帕尼5.0μM联合处理24小时，通过Transwell侵袭实验检测细胞侵袭活性。

L. 22Rv1和DU145细胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奥拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM与奥拉帕尼5.0μM联合处理48小时，然后通过高内涵成像分析系统进行18小时的细胞运动跟踪。

M. 通过高内涵成像分析系统分析图6L中22Rv1和DU145细胞的运动位移和速度。

7. METTL3抑制剂与PARP抑制剂协同作用，抑制体内PCa进展

图7：STM2457在体内与PARP抑制剂显示出协同抗前列腺癌效果。

A. 22Rv1细胞的异种移植肿瘤用空白对照、每天50mg/kg STM2457、每天50毫克/千克奥拉帕尼，以及每天50 mg/kg STM2457与50 mg/kg奥拉帕尼联合处理3周，最后一天拍摄肿瘤照片（n=5）。

B. 每三天监测一次肿瘤体积增长。

C. 最后一天用电子秤测量肿瘤重量。

D. 每三天用电子秤监测小鼠体重。

E. 对收获的肿瘤进行增殖（Ki-67）和凋亡（裂解的caspase 3）水平的免疫组化分析。

F. 对图7E中IHC结果的定量分析。

易小结

本研究地分析了METTL3抑制剂STM2457在不同细胞系、患者来源器官类器官(PDO)、细胞源异种移植模型(CDX)和患者源异种移植模型(PDX)中的前列腺癌(PCa)抑制活性。STM2457抑制了IGFBP3 3'UTR的m6A修饰，并促进IGFBP3的稳定和过表达。随后，IGFBP3降低了AKT的磷酸化水平，进而抑制METTL3过表达的PCa进展。此外STM2457诱导了DNA损伤，并在体外和体内均显示出与PARP抑制剂的协同抗PCa效果。本研究首次证明了METTL3抑制剂在体外和体内都能抑制PCa进展，并为进一步的临床试验提供了有意义的参考。

参考文献：

Chen X, Wang M, Wang H, Yang J, Li X, Zhang R, Ding X, Hou H, Zhou J, Wu M. METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor. Biomed Pharmacother. 2024 Sep 3;179:117366. pii: S0753-3322(24)01251-4. doi: 10.1016/j.biopha.2024.117366. PubMed PMID: 39232384.